利用全自動(dòng)蛋白芯片檢測(cè)法驗(yàn)證熱加工肉及含肉制品HACCP實(shí)施中的加熱效果

上海出入境檢驗(yàn)檢疫局  張 柳    韓 偉

 

 

摘 要 近年來我國(guó)出口至日本的熱加工禽肉、偶蹄類產(chǎn)品多次被日本農(nóng)林水產(chǎn)省查出加熱不充分，相關(guān)企業(yè)被令出口暫停，而判定依據(jù)是對(duì)出口樣品實(shí)施的可溶性蛋白SDS-PAGE電泳圖譜比對(duì)結(jié)果。我國(guó)對(duì)輸日相關(guān)產(chǎn)品尚未推廣利用變性蛋白電泳檢測(cè)法來推斷產(chǎn)品的受加熱程度，技術(shù)層面的落后使我們?cè)谥腥召Q(mào)易雙方談判中處于被動(dòng)狀態(tài)。本文從背景、意義、檢測(cè)原理、操作方案等角度研究了全自動(dòng)蛋白芯片檢測(cè)法做為熱加工肉及含肉食品HACCP實(shí)施中的加熱效果驗(yàn)證措施的可行性和展望前景。

 

關(guān)鍵詞 熱加工肉及含肉食品   技術(shù)壁壘    HACCP     蛋白變性      全自動(dòng)蛋白芯片檢測(cè)  

 

肉及含肉制品加工企業(yè)通常以殺滅特定致病性微生物為目的，通過蒸、煮、油炸或其他方式將經(jīng)處理后的肉及含肉制品加熱，并達(dá)到無致病性微生物和相關(guān)法規(guī)的安全衛(wèi)生要求。正是由于熱加工是一種非常有效的生物危害控制措施，因而得到了大多數(shù)生產(chǎn)企業(yè)的關(guān)鍵性重視---被確立為加工中的關(guān)鍵控制點(diǎn)。那么如何對(duì)此關(guān)鍵工序的執(zhí)行效果進(jìn)行驗(yàn)證呢？綜合來講，加熱過程中對(duì)監(jiān)控人員的監(jiān)控行為直接進(jìn)行觀察、審核加熱過程記錄、對(duì)加熱設(shè)備及其關(guān)鍵參數(shù)顯示、記錄設(shè)施進(jìn)行校準(zhǔn)、對(duì)加熱工藝進(jìn)行確認(rèn)、對(duì)加熱后產(chǎn)品做微生物檢測(cè)等方法都是可行且必須的熱加工效果驗(yàn)證措施。但是，近年來我國(guó)出口至日本的熱加工禽肉、偶蹄類產(chǎn)品多次被日本農(nóng)林水產(chǎn)省檢測(cè)出加熱不充分，相關(guān)企業(yè)被令出口暫停的事件，使我國(guó)對(duì)日出口熱加工偶蹄類、禽肉類產(chǎn)品再次面臨著嚴(yán)峻的技術(shù)貿(mào)易壁壘形勢(shì)。當(dāng)日方檢測(cè)部門出具加熱不充分樣品中變性蛋白電泳分析檢測(cè)結(jié)果時(shí)，我們無法質(zhì)疑且只能全盤接受，因?yàn)槲覀兊臋z測(cè)技術(shù)滯后了！因此，研究和建立一個(gè)直接、精確的檢測(cè)熱加工肉及肉制品加熱程度的方法，不但可以改變當(dāng)前我們?cè)诖隧?xiàng)檢測(cè)方面的不利處境，從而在應(yīng)對(duì)貿(mào)易壁壘中不再無語和啞然，更可以為我國(guó)進(jìn)口食品筑起一道技術(shù)高墻。

攻守兩易的技術(shù)貿(mào)易壁壘政策，讓我們開始了對(duì)基于蛋白質(zhì)變性的分子生物學(xué)原理而建立的凝膠電泳法的關(guān)注。

 

熱加工肉及含肉制品加熱效果驗(yàn)證的傳統(tǒng)方法與新方法

很多研究表明，加熱過程中肌肉的變化與加熱終點(diǎn)溫度之間存在聯(lián)系，如肌肉顏色、組織結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)性質(zhì)、酶活性的變化等。根據(jù)這些變化，已有多種驗(yàn)證加熱效果的產(chǎn)品檢測(cè)方法被開發(fā)和建立起來。

常規(guī)的產(chǎn)品加熱效果驗(yàn)證方法主要是感官檢測(cè)，即顏色、組織形態(tài)的判別法。動(dòng)物肌肉的肌紅蛋白加熱到65℃-80℃時(shí)會(huì)變性，使肌肉顏色傾向棕色，目測(cè)及可見分光光度計(jì)均可進(jìn)行判斷；而加熱引起的肌肉組織的結(jié)構(gòu)變化如肌纖維的收縮崩解等也可通過目測(cè)判斷。另外，骨髓凝固、血水消失等常識(shí)也被用于判定產(chǎn)品是否被充分加熱的感官指標(biāo)。感官檢測(cè)具有簡(jiǎn)便易行，快速直觀的特點(diǎn)，但其結(jié)果對(duì)經(jīng)驗(yàn)依賴性較大，一般難于量化，準(zhǔn)確性有波動(dòng)；另外，結(jié)果隨感官檢驗(yàn)施行人員不同而存在較為顯著的個(gè)體判斷差別。

天然蛋白質(zhì)的嚴(yán)密結(jié)構(gòu)在某些物理或化學(xué)因素作用下，其特定的空間結(jié)構(gòu)被破壞，從而導(dǎo)致理化性質(zhì)改變和生物學(xué)活性的喪失，稱為變性(denaturation)。動(dòng)物肌肉富含蛋白質(zhì)，加熱主要是破壞蛋白質(zhì)分子中的氫鍵，導(dǎo)致其溶解度降低，粘度增加，結(jié)晶性破壞，酶活性發(fā)生變化。根據(jù)加熱過程中蛋白質(zhì)的這些變化特點(diǎn)，通過檢測(cè)不同加熱程度的熱變性蛋白分子量便可對(duì)加熱終點(diǎn)溫度得出間接推斷。相關(guān)的方法有可溶性蛋白的SDS-PAGE電泳、Western-Blot法、蛋白凝聚試驗(yàn)、特定的酶活性測(cè)定以及對(duì)指示蛋白的免疫學(xué)檢測(cè)等。綜合方法的簡(jiǎn)便性、重復(fù)性和穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)的凝膠電泳分析不失為一種有效的驗(yàn)證肉類加熱程度的方法。而隨著新方法的完善，半自動(dòng)與全自動(dòng)的檢測(cè)儀器也有了較高的商業(yè)化程度，如微流芯片分離電泳的新產(chǎn)品ExperionTM全自動(dòng)電泳系統(tǒng)結(jié)合相應(yīng)的蛋白芯片, 可在30分鐘內(nèi)快速全自動(dòng)完成整個(gè)蛋白電泳及條帶分析。將其應(yīng)用于加熱變性蛋白的檢測(cè)，可迅速有效地判斷加熱終點(diǎn)溫度是否達(dá)到加工工藝和相關(guān)法規(guī)的要求，從而為HACCP實(shí)施提供了科學(xué)、便捷的有效性驗(yàn)證方法，尤其適合作為官方驗(yàn)證的一種舉措。

 

全自動(dòng)蛋白芯片檢測(cè)與監(jiān)測(cè)加熱程度的方法的具體步驟與結(jié)果

[材料]

樣品制備用儀器與試劑

PBS(0.01mol/L)；天平；Bagmixer擊拍器及Bagpage樣品袋；刻度吸管；低溫離心機(jī)；離心管；記號(hào)筆；中心溫度計(jì)等

Experion™ 系統(tǒng) 自動(dòng)電泳工作站和制膠工作站

試劑盒，包括微流芯片和用于蛋白質(zhì)分析的試劑，可分辯并定量從10到260 kD大小的蛋白質(zhì)樣本

電腦配置：Pentium 4，2GHz，512 K RAM，Windows 2K或XP，多重USB接口

樣品來源

熱加工含偶蹄類肉、禽肉類食品，包括不同加熱方式、不同加熱階段的半成品與成品樣品

[方法步驟]

樣本制備

將待檢的不同加熱程度食品樣品剪成大約10g左右，放入Bagpage樣品袋中，添加90mL PBS；

用Bagmixer擊拍器擊拍10min后靜置0.5hr；

取上清液，8000rpm低溫離心20min；

取離心上清液1mL，加入微量離心管，每管1mL，做標(biāo)記；

再在8，000rpm低溫離心 5min，備用。

2、芯片的制膠和加樣

1）使用前，所有試劑盒中的試劑達(dá)到室溫平衡，并輕輕振蕩混勻；

2）按蛋白質(zhì)分析試劑盒的使用手冊(cè)要求制膠和制樣。

3）將樣本和分子量標(biāo)記加入到芯片中，緩慢的加入芯片試劑，避免引入氣泡。

3、運(yùn)行分析

1）點(diǎn)擊電腦桌面上的Experion圖標(biāo)，運(yùn)行軟件；

2）將制膠并加樣的芯片應(yīng)立即或在5分鐘內(nèi)放入自動(dòng)電泳工作站中的芯片平臺(tái)上，固定妥當(dāng)，合上蓋子；

3）按操作界面要求運(yùn)行分析，波峰/電泳圖譜和膠視圖均可顯示，以監(jiān)測(cè)運(yùn)行的進(jìn)展結(jié)果。

[結(jié) 果]

不同加熱情況的偶蹄類肉、禽肉食品的蛋白質(zhì)變性情況

1）蒸汽加熱

樣品1：蒸制雞腿肉串（蒸前45G）

加熱方式與CCP要求：肉串進(jìn)入蒸箱內(nèi)，100℃蒸汽蒸12分鐘，肉中心溫度達(dá)到70℃以上并保持1分鐘以上。

 

樣品2： 35克小肉包（豬肉）

加熱方式與CCP要求：肉包進(jìn)入蒸箱，100℃蒸汽蒸制10分鐘，肉中心溫度達(dá)到70℃以上并保持1分鐘以上。

 

2）油炸加熱

樣品：裹漿油炸雞腿肉塊

加熱方式與CCP要求：第一次油炸（棕櫚油）160℃80秒；經(jīng)過10秒輸送帶后，進(jìn)行第二次油炸，165℃135秒；肉中心溫度為70℃以上并維持1分鐘以上。

 

3）烤制加熱

樣品：烤牛舌片

加熱方式：電烤720度3分鐘。

 

[討 論]

Experion™ 全自動(dòng)蛋白芯片檢測(cè)系統(tǒng)是一種基于熒光電泳的蛋白質(zhì)測(cè)定方法。將其應(yīng)用于禽、肉制品中加熱變性蛋白的檢測(cè)具有快速、簡(jiǎn)單、高效等特點(diǎn)，且能保證試驗(yàn)的重復(fù)性與穩(wěn)定性。

從對(duì)不同加熱方法和加熱程度的偶蹄類肉、禽類食品的蛋白質(zhì)變性情況的檢測(cè)結(jié)果來看，加熱方式對(duì)變性蛋白電泳圖譜的影響不大，產(chǎn)品在加熱過程中曾經(jīng)達(dá)到的最高中心溫度以及相應(yīng)的維持時(shí)間是影響蛋白圖譜條帶的主要因素。隨加工溫度的增高，維持時(shí)間的增加 ，蛋白質(zhì)的大分子量條帶趨于消失，而在小分子量區(qū)域的條帶不但不變，有時(shí)甚至有增多現(xiàn)象，這就提示了加熱過程可使大分子可溶蛋白變性而減少。反言之，根據(jù)蛋白電泳圖譜可提示肉、禽產(chǎn)品是否經(jīng)過適當(dāng)有效的加熱處理，驗(yàn)證加熱效果。

 

全自動(dòng)蛋白芯片檢測(cè)法做為熱加工肉及含肉制品HACCP體系驗(yàn)證措施的前景和展望

上述討論結(jié)果給我們帶來了通過全自動(dòng)蛋白芯片檢測(cè)法來驗(yàn)證熱加工肉類產(chǎn)品是否達(dá)到法規(guī)要求的加熱程度的全新視點(diǎn)。我們可以這樣做：將成品樣品分成兩份，一份直接按照上述方法步驟進(jìn)行檢測(cè)，得出圖譜（如下圖3）；將另一份進(jìn)行水浴或蒸等加熱處理，但在這過程中須嚴(yán)格控制樣品的加熱程度不能超出法規(guī)臨界要求，比如按日本農(nóng)林水產(chǎn)省相關(guān)要求，使樣品在中心溫度達(dá)到70度開始維持并計(jì)時(shí)1分鐘后中止加熱，然后做電泳檢測(cè)并得出另一張圖譜（如下圖4）。根據(jù)蛋白加熱變性的不可逆性，加熱充分的成品樣品即使經(jīng)過再次加熱，其圖譜的前后變化也不大，而加熱不充分的成品樣品經(jīng)過再次加熱后蛋白圖譜會(huì)有較大的差異。通過兩個(gè)圖譜的對(duì)比判斷，可判斷樣品所代表的成品是否達(dá)到了法規(guī)基本加熱要求。但值得注意的是，樣品按法規(guī)要求進(jìn)行熱處理時(shí)務(wù)必“見好就收”，即控制好中心溫度和維持時(shí)間，以免得到超出實(shí)際法規(guī)加熱限值的圖譜而做出誤判。

 

讓我們把目光再次投向近年來的多起輸日熱加工禽肉、偶蹄類肉產(chǎn)品的加熱不充分事件：日本農(nóng)林水產(chǎn)省對(duì)從中國(guó)大陸進(jìn)口熱加工含偶蹄類肉、禽肉類產(chǎn)品的動(dòng)物衛(wèi)生要求中明確規(guī)定了幾種不同加熱方式的加熱要求，并據(jù)此開展貿(mào)易產(chǎn)品的驗(yàn)證性檢測(cè)，“加熱不充分”事件的判定也就是基于樣品熱處理前后的蛋白電泳圖譜比對(duì)；不過據(jù)了解，他們尚未采取全自動(dòng)蛋白芯片檢測(cè)，因而試驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性和穩(wěn)定性較差，況且法規(guī)加熱限值圖譜是否存在偏差也不得而知。相信如果我們?cè)趯?duì)日出口熱加工禽肉、偶蹄類肉產(chǎn)品貿(mào)易中開展了一定規(guī)模的變性蛋白電泳檢測(cè)來驗(yàn)證產(chǎn)品的加熱效果，我們就會(huì)有足夠的底氣和數(shù)據(jù)與日本農(nóng)林水產(chǎn)省等部門平等對(duì)話和交流，只有建立了蛋白變性圖譜與不同加熱程度的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)平臺(tái)，才可以防止日本有關(guān)部門隨意將穩(wěn)定性、重復(fù)性有待質(zhì)疑的蛋白質(zhì)電泳檢測(cè)結(jié)果作為判斷產(chǎn)品是否滿足其法規(guī)要求的單方面行為，同時(shí)也可以為我國(guó)進(jìn)口同類產(chǎn)品設(shè)立科學(xué)、易行的技術(shù)壁壘手段。

因此，我們滿懷信心：將全自動(dòng)蛋白芯片檢測(cè)驗(yàn)證產(chǎn)品法運(yùn)用于熱加工含肉食品HACCP實(shí)施中的產(chǎn)品加熱效果驗(yàn)證勢(shì)在必行，且有著非常實(shí)用的前景！

 

 

參 考 文 獻(xiàn)

1. Experion™ 系統(tǒng)使用手冊(cè)，伯樂生命科學(xué)有限公司

2. JIS 3837-1995, SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳分析通則

3. 劉恒等，生豬肉與加熱豬肉SDS-PAGE電泳檢測(cè)方法的研究，口岸衛(wèi)生控制，第9卷第1期，14-15

4. 賀艷等，肉類加熱重點(diǎn)溫度檢測(cè)方法的研究進(jìn)展，F(xiàn)ood&Machiney,2004(4),22-24

 

2007年6月