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常見菌落總數(shù)的操作方法

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期：2024-04-28
核心提示： 菌落總數(shù)又稱需氧菌總數(shù)、嗜氧菌總數(shù)，在英文標準中的術語有Total plate count, Standard plate-count bacteria, Aerobic
 菌落總數(shù)又稱需氧菌總數(shù)、嗜氧菌總數(shù)，在英文標準中的術語有Total plate count, Standard plate-count bacteria, Aerobic bacterial count，Colonies number等，是微生物學檢測技術中應用最廣泛的一種衛(wèi)生學檢測技術，亦是嗜溫細菌和真菌的菌落總計數(shù)，其通過一定條件下如需氧情況、營養(yǎng)條件、pH、培養(yǎng)溫度和時間等，每單位（如克、毫升等）檢樣所生長出來的微生物，在衛(wèi)生學上可以表示被污染程度的標志。

 

常見操作方法

 

菌落計數(shù)方法包括平皿法、薄膜過濾法和最可能數(shù)法（Most-Probable-Number Method，簡稱MPN法），其中平皿法可分為傾注平皿法和涂布平皿法，常見的菌落總數(shù)操作方法見表1。 

 






表1 常見菌落總數(shù)的操作方法匯總





 

測試標準

適用范圍

操作方法

GB4789.2-2022 《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》

食品

傾注平皿法/菌落總數(shù)測試片

FDA- Bacteriological Analytical Manual Chapter 3：2001《Aerobic Plate Count》

食品

傾注平皿法/螺旋板法

GB/T13093-2006 《飼料中細菌總數(shù)的測定》

飼料

傾注平皿法

GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物檢驗方法 細菌總數(shù)測定》

游泳池水

傾注平皿法

GB/T5750.12—2023《生化飲用水標準檢驗方法  微生物指標》

飲用水/水源水

傾注平皿法/酶底物法

WS 394-2012 《公共場所集中空調(diào)通風系統(tǒng)衛(wèi)生規(guī)范 附錄D 集中空調(diào)送風中細菌總數(shù)檢驗方法》

環(huán)境

六級篩孔撞擊式微生物采樣器

GB15979-2002 《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準  附錄B2》

一次性衛(wèi)生用品

傾注平皿法

《化妝品安全技術規(guī)范》2015版

化妝品

傾注平皿法

BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》

化妝品

平皿法/膜過濾法

USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: MICROBIAL ENUMERATION TESTS》

藥品

平皿法/薄膜過濾法/MPN法

BP Appendix XVI B  《Microbiological Examination of Non-sterile Products》

EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》

ChP1105 2020版《非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物限度計數(shù)》

 

根據(jù)上表的適用范圍和操作方法可得出，平皿法是使用范圍最廣。

 

根據(jù)測試標準適用范圍和樣品特性：

A.平皿法因可操作性性強，會更多用于污染度高的被檢樣品；

B.薄膜過濾法適用于測試量需求大且污染度一般的液體樣品；

C.MPN法可用于微生物計數(shù)時精確度較差時，包括對于某些微生物污染度很小的樣品。

 

故在日常測試中，可根據(jù)樣品的污染度情況去選擇更合適的菌落總數(shù)測試操作方法。

 

樣品的取樣量與稀釋液選擇

樣品的取樣量與其質(zhì)量標準或測試方法去選擇，對于官方標準未明確取樣量的，亦可根據(jù)結(jié)果的代表性加大取樣量。稀釋緩沖液的選擇則是要求樣品在稀釋緩沖液中能夠充分混合，從而保證樣品的均一性，故不同樣品，會有不同的稀釋液需求。日常工作中，常見的稀釋緩沖液與要求見表2。

 






表2 常見的稀釋緩沖液信息匯總





 

 

測試標準

樣品量

稀釋液

備注

GB4789.2-2022 《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》

25g/mL

無菌生理鹽水/磷酸鹽緩沖液

  

FDA- Bacteriological Analytical Manual Chapter 3：2001《Aerobic Plate Count》

50g/mL

磷酸鹽緩沖液/無菌水

  

GB/T13093-2006 《飼料中細菌總數(shù)的測定》

25g/10g

0.85%生理鹽水/磷酸鹽緩沖液

  

GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物檢驗方法 細菌總數(shù)測定》

原液

無菌生理鹽水

  

GB/T5750.12—2023《生化飲用水標準檢驗方法  微生物指標》

原液

無菌生理鹽水

  

WS 394-2012 《公共場所集中空調(diào)通風系統(tǒng)衛(wèi)生規(guī)范 附錄D 集中空調(diào)送風中細菌總數(shù)檢驗方法》

28.3L/min，（5-15）min

不適用

  

GB15979-2002 《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準  附錄B2》

10±1g

無菌生理鹽水（200mL）

不進行梯度稀釋，做5平行

《化妝品安全技術規(guī)范》2015版

10g/mL

無菌生理鹽水

無法充分溶解稀釋液中的樣品可加吐溫80和/或石蠟

BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》

1:10（樣品：加稀釋液后）

無菌生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液等

 

最終的取樣量與稀釋液，需通過樣品方法學適用性驗證方能使用。

USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS:MICROBIAL ENUMERATION TESTS》

BP Appendix XVI B  《Microbiological Examination of Non-sterile Products》

EP  9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》

ChP1105 2020版《非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物限度計數(shù)》

 

 

常見培養(yǎng)條件

菌落總數(shù)的培養(yǎng)條件會因不同的樣品類型或制定機構而有所差異，其差異包括培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間的選擇。菌落總數(shù)常見的培養(yǎng)條件見表3。

 






表3 菌落總數(shù)的常見培養(yǎng)條件匯總





 

 

測試標準

培養(yǎng)基

培養(yǎng)溫度

培養(yǎng)時間

GB4789.2-2022 《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》

平板計數(shù)瓊脂（PCA）

36±1℃（水產(chǎn)品30±1℃）

48±2h（水產(chǎn)品72±3h）

FDA-Bacteriological Analytical Manual Chapter 3：2001《Aerobic Plate Count》

35±1℃（牛奶32±1℃）

48±2h

GB/T13093-2006 《飼料中細菌總數(shù)的測定》

營養(yǎng)瓊脂（NA）

30±1℃

72±3h

GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物檢驗方法 細菌總數(shù)測定》

36±1℃

48h

GB/T5750.12—2023《生化飲用水標準檢驗方法  微生物指標》

36±1℃

48±2h

WS 394-2012 《公共場所集中空調(diào)通風系統(tǒng)衛(wèi)生規(guī)范 附錄D 集中空調(diào)送風中細菌總數(shù)檢驗方法》

35~37℃

48h

GB15979-2002 《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準  附錄B2》

35±2℃

48h后

《化妝品安全技術規(guī)范》2015版

卵磷脂、吐溫80-營養(yǎng)瓊脂 （LTNA）

36±1℃

48±2h

BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）

32.5±2.5oC

 

72±6h

USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: MICROBIAL ENUMERATION TESTS》

3~5天

BP Appendix XVI B  《Microbiological Examination of Non-sterile Products》

EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》

ChP1105 2020版《非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物限度計數(shù)》

 

 

結(jié)果觀察與報告

菌落總數(shù)在進行計數(shù)時，肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應的菌落數(shù)量。菌落計數(shù)以菌落形成單位（CFU/cfu，Colony Forming Units）進行報告。在計數(shù)時，首先需明確計數(shù)范圍是否符合要求，從而保證測試結(jié)果的準確性和可靠性，不同的測試方法在首選計數(shù)范圍會有一定差異，以及顯色劑在觀察中的應用也有一定的要求。詳情見表4。

 






表4  結(jié)果觀察與報告的一般要求





 

測試標準

培養(yǎng)基中是否可加顯色劑1

首選計數(shù)范圍

最終結(jié)果報告

GB4789.2-2022 

《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》

是

30~300cfu

100cfu以內(nèi)報整數(shù)，超過100cfu兩位有效數(shù)字，＞300cfu的則報告TNTC2，采用“四舍五入”。

FDA-Bacteriological Analytical Manual Chapter 3：2001《Aerobic Plate Count》

否

25~250cfu

＜25cfu則報告＜25或?qū)嶋H值，＞250cfu則報告＞250或TNTC2。

GB/T13093-2006 《飼料中細菌總數(shù)的測定》

否

30~300cfu

100cfu以內(nèi)報整數(shù)，超過100cfu兩位有效數(shù)字，＞300cfu的則報告TNTC2。采用“四舍五入”。

GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物檢驗方法 細菌總數(shù)測定》

否

30~300cfu

100cfu以內(nèi)報整數(shù)，超過100cfu兩位有效數(shù)字，＞300cfu的則報告TNTC2。采用“四舍五入”。

GB/T5750.12—2023《生化飲用水標準檢驗方法  微生物指標》

否

30~300cfu

100cfu以內(nèi)報整數(shù)，超過100cfu兩位有效數(shù)字，＞300cfu的則報告TNTC2。采用“四舍五入”。

WS 394-2012 《公共場所集中空調(diào)通風系統(tǒng)衛(wèi)生規(guī)范 附錄D 集中空調(diào)送風中細菌總數(shù)檢驗方法》

否

無

報告cfu/m3

GB15979-2002 《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準  附錄B2》

否

無

全部無生長報＜4cfu/g（mL），若生長，報100cfu以內(nèi)報整數(shù)，超過100cfu兩位有效數(shù)字。

《化妝品安全技術規(guī)范》2015版

是

30~300cfu

100cfu以內(nèi)報整數(shù)，超過100cfu兩位有效數(shù)字，＞300cfu的則報告TNTC2。采用“四舍五入”。

BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》

否

平皿法：30~300cfu；薄膜過濾法：15~150cfu。

100cfu以內(nèi)報整數(shù)，超過100cfu兩位有效數(shù)字。

USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION

OF NONSTERILE PRODUCTS: MICROBIAL ENUMERATION TESTS》

否

平皿法：不超過250cfu；薄膜過濾法：記錄結(jié)果。

取兩位有效數(shù)字報告

BP Appendix XVI B  《Microbiological Examination of Non-sterile Products》

EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》

ChP1105 2020版《非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物限度計數(shù)》

否

平皿法：不超過300cfu；薄膜過濾法：不超過100cfu

取兩位有效數(shù)字報告

注：

1. 顯色劑一般為TTC，TTC全稱為0.5%氯化三苯四氮唑。加此顯示劑后，多數(shù)菌落顯示紅色。

2. TNTC全稱為多不可數(shù)，即Too Number To Count。

 

菌落總數(shù)的測定，不同樣品有不同的特性，故在進行此方面衛(wèi)生學測試時，結(jié)合行業(yè)需求，以及樣品的生產(chǎn)工藝、消費對象、使用方式等需求，選擇合適的測試操作流程，同時保證在報告結(jié)果時，亦需根據(jù)市場所選用的方法進行報告結(jié)果。

 

綜合以上，衛(wèi)生學的菌落測試在實驗操作中雖然有差異，但總體的差異性不大，比如培養(yǎng)基都是非選擇性生長培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度基本在35℃左右，培養(yǎng)時間則溫度越高，時間則可減少。故保證菌落總數(shù)測試結(jié)果的準確性與可靠性時，根據(jù)實際需求，通過調(diào)節(jié)測試方法的取樣、稀釋液、培養(yǎng)條件等來建立更符合本實驗室的菌落總數(shù)測試方法。



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編輯：songjiajie2010

 
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