保藏方法不一樣，活化方法就不一樣，都是一一對應的。我們不能強制性的張冠李戴，那樣做出來試驗效果會有一定折扣。為了這個折扣，我們有必要探討一下菌種保藏方法和不同保藏方法對應的活化方法。
一、微生物菌種保藏的目的
盡可能的保持菌種的原有性狀和生理活性，不變異、不死亡、不污染、不退化。
菌種保藏最重要的目的就在于如何保持優(yōu)良菌種其優(yōu)良性狀的穩(wěn)定，滿足生產(chǎn)的實際需要。
二、微生物菌種保藏的原理
1. 使微生物的代謝作用降至極低限度，使其處于不活躍的休眠狀態(tài)。通過降低微生物體內(nèi)的代謝，抑制生長繁殖，從而延長菌種的生命，減少變異。2. 從微生物本身來說，就是要挑選典型菌種的優(yōu)良純種，最好采用他們的休眠體，比如說芽孢、孢子等。從環(huán)境條件來說，就是要創(chuàng)造一個適合長期休眠的環(huán)境條件，比如低溫、干燥、缺氧、避光、缺乏營養(yǎng)以及添加保護劑或酸度中和劑等。大多數(shù)菌種的保藏方法都是根據(jù)這些因素或其中部分因素而設計的。
3. 微生物具有易異變的特性，在保藏過程必須使微生物代謝處于最不活躍的狀態(tài)但又不死亡，才能在一定的時間內(nèi)使其不發(fā)生變異或少發(fā)生變異而又保持生命活力。
三、菌種保藏方法和不同保藏方法對應的活化方法
（一）斜面保藏法和活化
1. 斜面保藏法操作步驟
斜面保藏法的原理：將斜面保存在4℃條件下，創(chuàng)造低溫環(huán)境，降低菌種活力。再加上斜面接種面積大，開口小，也相應地減少了污染的機會。斜面制備好后，最好在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩天，檢驗是否有污染。
平板轉接斜面和斜面轉接斜面，都是沒有問題，但一定要確保保藏的菌種沒有污染后，再進行轉接。
一般情況下，近期兩個月內(nèi)不可能使用、也有可能使用的菌種，都可以采用斜面保藏法保藏。
(4)保藏期
一般保藏期為兩個月，最好不超過兩個月。時間過長，斜面脫水，菌種也會脫水死亡。
但也要根據(jù)情況進行判斷，比如說，斜面沒有什么變化，菌種也沒有明顯污染，也可以繼續(xù)保藏，但最好轉接出來較為妥當。
(5)優(yōu)點
操作簡便，沒有復雜的工序，不需要特殊設備，成本低，容易觀察，隨時觀察菌種的狀態(tài)，復蘇方便。
制作斜面一般用玻璃試管，比較透明，可以定期觀察菌種變化，如果發(fā)現(xiàn)污染或斜面脫水等狀況，立即轉種。
(6)缺點
保藏期短，菌種容易變異，易污染。
因斜面上只有固體培養(yǎng)基，沒有特殊的保護措施，所以培養(yǎng)基本身會發(fā)生變化，因保藏期短，就需要經(jīng)常傳代，傳代過程中增加污染的機會。
2. 斜面保藏菌種活化
斜面保藏法活化菌種比較簡單，直接用接種環(huán)挑取單菌落，采用“Z”字劃線法在斜面上連續(xù)劃線，放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待培養(yǎng)完成保存至4℃保存。
（二）甘油管保藏法和活化
1.甘油管保藏法操作步驟
甘油管保藏是實驗室常用的菌種保藏方法，它的原理在于，一定濃度的甘油，可以降低水的結冰溫度，有效地防止細胞內(nèi)部形成冰晶，甘油還可以與細胞內(nèi)部分子結合，從而形成細胞的保護層，起到保護細胞的作用。此外，甘油還是一種有機碳源，可以為細胞提供一定量的碳源和能源，使其保持活力狀態(tài)。
甘油比較粘稠，一般采用質量比配制即可。
甘油管保藏法中，甘油的終濃度20%-30%即可。
值得注意的是，配好后一定要混勻，甘油密度比較大，會沉淀到底部，如果不混勻，滅菌效果可能不太好。
(2)甘油管保藏
液體菌種：將培養(yǎng)好的液體菌種和甘油按比例混勻，一般甘油的終濃度20%-30%。
我一般使用50%甘油和菌液1:1混勻，-80℃保藏即可。
平板或斜面菌種：用無菌水重懸菌種后，與50%甘油1:1混勻，-80℃保藏即可。
通常使用甘油的終濃度在20%~30%，該范圍外的濃度會對細胞產(chǎn)生毒性，質粒會很容易丟失，甘油濃度太低起不到作用，太高又會影響菌種活性。
一般保藏時間為一年。在實際操作中，一年以上也沒問題。操作簡單，保藏期較長，菌種不容易發(fā)生變異。不容易觀察，不易監(jiān)測菌種變化，不宜反復凍融。將甘油管從-80℃取出，融化后，直接用接種環(huán)挑取一環(huán)，采用劃線法在固體培養(yǎng)基上劃線，適宜溫度下倒置培養(yǎng)即可�；蛘哂脽o菌水適當稀釋后涂布至平板培養(yǎng)基中，培養(yǎng)。
小提示：
一種說法，甘油管保藏菌種需要“慢凍快化”，即-80℃保藏前，先-20℃預凍，再放入-80℃保藏；取出使用時，直接放入37℃快速融化后使用。
另一種說法，甘油管保藏菌種需要“慢凍慢化”，即-80℃保藏前，先-20℃預凍，再放入-80℃保藏；取出使用時，逐級融化后使用。
實際使用時，甘油管直接-80℃冷凍保藏，使用時取出來直接用手捂熱使用，也是符合第一種說法的。效果到底哪種方式好，還需要繼續(xù)研究，等待進一步數(shù)據(jù)。
（三）穿刺保藏法和活化
1.穿刺保藏法操作步驟
穿刺保藏法原理是缺氧和低溫，即菌種保存在半固體培養(yǎng)基內(nèi)部，造成缺氧環(huán)境，然后保存于4℃，延長菌種時間。
(1)制備半固體培養(yǎng)基
半固體培養(yǎng)基跟固體培養(yǎng)基的區(qū)別在于瓊脂粉含量不同，前者瓊脂粉含量1%，后者含量1.5%-2%。
半固體培養(yǎng)基添加至無菌試管約1/3處，營養(yǎng)不宜太豐富。值得注意的是，半固體培養(yǎng)基配制好后需要豎起來，不需要擺斜面。
(2)接種
用接種針挑取少量細菌，從半固體培養(yǎng)基的中心垂直刺入，直至接近半固體培養(yǎng)基1/2處自上而下穿刺，不要穿透，然后沿原穿刺線將接種針退出，穿入培養(yǎng)基若干次，放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待微生物生長良好后，用2毫米無菌液體石蠟覆蓋，以創(chuàng)造缺氧環(huán)境并4℃保藏。
有的菌種保存時間至少可以達到1 年，有的菌種甚至能達到20 年之久。適用于工程大腸桿菌等細菌，操作簡便，保存時間較長。
(6)缺點
比較耗費空間，不便于攜帶。
2.穿刺保藏菌種活化
用接種環(huán)沿著菌種方向穿入，挑取菌種，轉接至斜面上或平板培養(yǎng)基上，或加入無菌水搖晃，稀釋涂布即可。
（四）液體石蠟保藏法
液體石蠟保藏法實際上是斜面保藏法的一種改進形式。它的原理基于斜面保藏菌的基礎上，覆蓋一層液體石蠟，創(chuàng)造缺氧環(huán)境而保存于4℃。
根據(jù)需要，將液體石蠟進行分裝密封，放置于高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)121℃滅菌30min，滅菌完成后放置于40℃恒溫箱中蒸發(fā)水分，約4天，或105℃烘箱中1h，待水分蒸發(fā)完全后，備用。將無菌干燥的液體石蠟注入上述培養(yǎng)好的斜面上，加入石蠟的量以高于斜面頂端1cm為宜，再將試管密封，直立于4℃左右冷藏保存。覆蓋滅菌的液體石蠟，一方面可防止因培養(yǎng)基水分蒸發(fā)而引起菌種死亡，另一方面可阻止氧氣進入，以減弱代謝作用。要定期添加石蠟保證斜面處于液面以下。
(4)保藏時間
保藏時間至少可以達到1年，甚至更長。
一般情況，不產(chǎn)芽孢細菌保藏1年，芽孢菌、放線菌、霉菌可保藏2年，酵母菌可保藏1-2年。
將保藏的斜面取出來，用接種環(huán)從液體石蠟下挑取少量菌種，適當在試管內(nèi)壁輕點幾下，減少石蠟量，然后采用劃線法接種于新鮮平板上培養(yǎng)，待生長良好，再次傳代，培養(yǎng)。(2)移植菌種時，接種針上帶有石蠟和菌體，火焰滅菌時易飛賤、爆發(fā)，嚴防感染。(3)由于取出的菌種帶有一定量的液體石蠟，生長較慢且有粘性，因此，需要傳代2次。
（五）沙土管保藏法
沙土管干燥保藏法的原理是在沙土干燥條件下微生物細胞代謝活動減緩，繁殖速度受到抑制，這樣減少菌株突變，延長菌株存活時間。將培養(yǎng)好的菌種與無菌沙土混合，使菌體吸附在沙土載體上，干燥后保存。
1.沙土管保藏法
(1)處理沙土
將沙和土洗凈、烘干、過40目篩子，將沙與土以2:1的比例混合、分裝（每管1g沙土），滅菌，烘干。
(3)抽干、封口
將孢子懸液加入無菌的沙土管中，每管0.5mL，通過減壓干燥的方式去除沙土管中水分，直至水分被抽干，最后用石蠟或橡膠塞封口。
沙土管主要是通過創(chuàng)造干燥和寡營養(yǎng)的條件來保藏菌種。操作的時候應該注意抽干一步務必要快，盡量在12h內(nèi)完成，防止孢子萌發(fā)，降低保藏效果。兩年左右，根據(jù)菌種特性，保藏時間可能更長。適用于能產(chǎn)生孢子的微生物，如霉菌、放線菌，能形成芽孢的芽孢桿菌也可以采用該方法。保藏效果好，適用性也較廣泛，在抗生素生產(chǎn)工廠應用廣泛。取出少量沙土顆粒，放入適宜的液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，或在固體培養(yǎng)基表面涂抹后培養(yǎng)。(1)需要選擇適合的沙土材料，排水性好、顆粒細小均勻、無害菌和病原菌，并且不含明顯異味。
(2)嚴格消毒和無菌操作。
（六）冷凍真空干燥保藏法
冷凍真空干燥保藏法的原理是將菌種冷凍，在減壓下利用升華作用去除水分，使細胞的生理活動趨于停止，從而使菌種長期維持存活的狀態(tài)。
1.冷凍真空干燥保藏法
(1)制備菌懸液
將處于成熟期的微生物培養(yǎng)物懸浮于無菌的脫脂奶粉或者海藻糖等保護劑中制成濃菌液，分裝到無菌的安瓿瓶中。將上述安瓿瓶放置于低溫冰箱中冷凍，達到預定溫度后對濃菌液進行冷凍干燥處理，之后在真空狀態(tài)下融封安瓿瓶，于20℃保藏。五到十年，因保藏期較長，一定要標記清楚，以免遺忘。適用于大批量菌種的長期保存。該保藏法是目前適用范圍最廣，保藏效果最好的方法，如果需要長期保藏就選擇這種方法。適用范圍廣，保藏效果好，存活率高，變異小，便于攜帶。因涉及到冷凍抽真空設備，一般實驗室不具備條件，需要到專門保藏機構保藏，成本增加。
先用浸過75%酒精的脫脂棉擦凈安瓿管，用酒精燈火焰將安瓿管頂端適度加熱，然后用移液器取少量無菌水，將無菌水滴至加熱的安瓿管頂端使玻璃開裂，最后用挫刀或鑷子敲下已開裂的安瓿管的頂端。
先用移液器吸取0.3-0.5mL適宜的液體培養(yǎng)基，滴人安瓿管內(nèi)，輕輕振蕩，使菌體溶解呈懸浮狀，然后取0.1-0.2mL菌體懸浮液，移植于適宜的斜面或平板培養(yǎng)基上，剩余的菌液，注入適宜的液體培養(yǎng)基內(nèi)，適宜的溫度下培養(yǎng)。
（七）液氮超低溫保藏法
液氮超低溫保藏法主要是利用微生物在低于-130°C的低溫下新陳代謝趨于停止的原理，在液氮中（-196°C的超低溫下）有效地進行菌種保藏的方法。
離心收集對數(shù)生長期微生物細胞，用新鮮的培養(yǎng)基重懸微生物細胞。一般使用20%甘油和上述菌懸液等體積混勻，加入無菌的安瓿瓶中。將上述安瓿瓶緩慢預冷，最后移至液氮罐中的液相（-196℃）或氣象相（-156℃）作長期超低溫保藏。需要液氮罐等特殊設備，且管理費用高、操作較復雜、攜帶不便。
四、菌種保藏共同點
2.所保藏的微生物在保藏時處于良好的狀態(tài)。3.防止退化的發(fā)生。所以，保藏期一到，準備轉接重新保種。
總之，菌種保藏是微生物學的重中之重，根據(jù)微生物的習性和使用時間，選擇合適的保藏方法。
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