相差顯微鏡是一種將光線通過透明標(biāo)本細(xì)節(jié)時所產(chǎn)生的光程差（即相位差）轉(zhuǎn)化為光強(qiáng)差的特種顯微鏡。

光線通過比較透明的標(biāo)本時，光的波長（顏色）和振幅（亮度）都沒有明顯的變化。因此，用普通光學(xué)顯微鏡觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本（如活的細(xì)胞）時，其形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)往往難以分辨。然而，由于細(xì)胞各部分的折射率和厚度的不同，光線通過這種標(biāo)本時，直射光和衍射光的光程就會有差別。隨著光程的增加或減少，加快或落后的光波的相位會發(fā)生改變（產(chǎn)生相位差）。光的相位差人的肉眼感覺不到，但相差顯微鏡能通過其特殊裝置——環(huán)狀光闌和相板，利用光的干涉現(xiàn)象，將光的相位差轉(zhuǎn)變?yōu)槿搜劭梢圆煊X的振幅差（明暗差），從而使原來透明的物體表現(xiàn)出明顯的明暗差異，對比度增強(qiáng)，使我們能比較清楚的觀察到普通光學(xué)顯微鏡和暗視野顯微鏡下都看不到或看不清的活細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的某些細(xì)微結(jié)構(gòu)。

（二）相差顯微鏡的成像原理 
鏡檢時光源只能通過環(huán)狀光闌的透明環(huán)，經(jīng)聚光器后聚成光束，這束光線通過被檢物體時，因各部分的光程不同，光線發(fā)生不同程度的偏斜（衍射）。由于透明圓環(huán)所成的像恰好落在物鏡后焦點平面和相板上的共軛面重合。因此，未發(fā)生偏斜的直射光便通過共軛面，而發(fā)生偏斜的衍射光則經(jīng)補(bǔ)償面通過。由于相板上的共軛面和補(bǔ)償面的性質(zhì)不同，它們分別將通過這兩部分的光線產(chǎn)生一定的相位差和強(qiáng)度的減弱，兩組光線再經(jīng)后透鏡的會聚，又復(fù)在同一光路上行進(jìn)，而使直射光和衍射光產(chǎn)生光的干涉，變相位差為振幅差。這樣在相差顯微鏡鏡檢時，通過無色透明體的光線使人眼不可分辨的相位差轉(zhuǎn)化為人眼可以分辨的振幅差（明暗差）。

（三）相差顯微鏡的結(jié)構(gòu)和裝置 　

相差顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)是相同的，所不同的是它具有四部分特殊結(jié)構(gòu)：即環(huán)狀光闌、相板、合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡及綠色濾光片。

1、環(huán)狀光闌 具有環(huán)形開孔的光闌。位于聚光器的前焦點平面上，光闌的直徑大小是與物鏡的放大倍數(shù)相匹配的，并有一個明視場光闌，與聚焦器一起組成轉(zhuǎn)盤聚光器。在使用時只要把相應(yīng)的光闌轉(zhuǎn)到光路即可。

2、相板 位于物鏡內(nèi)部的后焦平面上。相板上有兩個區(qū)域，直射光通過的部分叫“共軛面”，衍射光通過的部分叫“補(bǔ)償面”。帶有相板的物鏡叫相差物鏡，常以“Ph”字樣標(biāo)在物鏡外殼上。

相板上鍍有兩種不同的金屬膜：吸收膜和相位膜。吸收膜常為鉻、銀等金屬在真空中蒸發(fā)而鍍成的薄膜，它能把通過的光線吸收掉60%—93%，相位膜為氟化鎂等在真空中蒸發(fā)鍍成，它能把通過的光線相位推遲1/4波長。

　　
根據(jù)需要，兩種膜有不同的鍍法，從而制造出不同類型的相差物鏡。如果吸收膜和相位膜都鍍在相反的共軛面上，通過共軛面的直射光不但振幅減弱，而且相位也被推遲1/4λ，衍射光因通過物體時相位也被推遲1/4λ，這樣就使得直射光與衍射光維持在同一個相位上。根據(jù)相長干涉原理，合成光等于直射光與衍射光振幅之和，因背景只有直射光的照明，所以通過被檢物體的合成光就比背景明亮。這樣的效果叫負(fù)相差，鏡檢效果是暗中之明。

　　
如果吸收膜鍍在共軛面，相位膜鍍在補(bǔ)償面上，直射光僅被吸收，振幅減少，但相位未被推遲，而通過補(bǔ)償面的衍射光的相位，則被推遲了兩個1/4λ，因此衍射光的相位要比直射光相位落后1/2λ。根據(jù)相消干涉原理，這樣通過被檢物體的合成光要比背景暗，這種效果叫正相差，即鏡檢效果是明中之暗。

　　
負(fù)相差物鏡（Negative　contrast）用縮寫字母“N”表示，正相差物鏡（Positive contrast）用縮寫字母“P”表示，由于吸收膜對通過它的光線的透過率不同，可分為高、中、低及低低，如Olympus光的透過率分為：7%、15%、20%、40%四個等級，因此分為高（High略寫為H），中（Medium略寫為M），低（Low略寫為L）及低低（Low—Low略寫成LL）四類，構(gòu)成了負(fù)高（NH）、負(fù)中（NM）、正低（PL）和正低低（PLL）四種類型相差物鏡，這些字母符號都寫在相差物鏡的外殼上。可根據(jù)被檢物體的特性來選擇使用不同類型的相差物鏡。

3、合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡 是相差顯微鏡一個極為重要的結(jié)構(gòu)。環(huán)狀光闌的像必須與相板共軛面完全吻合，才能實現(xiàn)對直射光和衍射光的特殊處理。否則應(yīng)被吸收的直射光被泄掉，而不該吸收的衍射光反被吸收，應(yīng)推遲的相位有的不能被推遲，這樣就不能達(dá)到相差鏡檢的效果。由于環(huán)狀光闌是通過轉(zhuǎn)盤聚光器與物鏡相匹配的，因而環(huán)狀光闌與相板常不同軸。為此，相差顯微鏡配備有一個合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡（在鏡的外殼上標(biāo)有“CT”符號），用于合軸調(diào)節(jié)。使用時撥去一側(cè)目鏡，插入合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡，旋轉(zhuǎn)合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡的焦點，便能清楚看到一明一暗兩個圓環(huán)。再轉(zhuǎn)動聚光器上的環(huán)狀光闌的兩個調(diào)節(jié)鈕，使明亮的環(huán)狀光闌圓環(huán)與暗的相板上共軛面暗環(huán)完全重疊。如明亮的光環(huán)過小或過大，可調(diào)節(jié)聚光器的升降旋鈕，使兩環(huán)完全吻合。如果聚光器已升到最高點或降到最低點而仍不能矯正，說明玻片太厚了，應(yīng)更換。調(diào)好后取下望遠(yuǎn)鏡，換上目鏡即可進(jìn)行鏡檢觀察。

4、綠色濾光片 由于使用的照明光線的波長不同，常引起相位的變化，為了獲得良好的相差效果，相差顯微鏡要求使用波長范圍比較窄的單色光，通常是用綠色濾光片來調(diào)整光源的波長。Olympus廠家生產(chǎn)的相差顯微鏡在鏡檢時要使用該廠規(guī)定的IF550綠色濾光片作為配套器件。

（四）相差顯微鏡的使用范圍、操作步驟及注意事項

1、使用范圍 相差顯微鏡能觀察到透明樣品的細(xì)節(jié)，適用于對活體細(xì)胞生活狀態(tài)下的生長、運(yùn)動、增殖情況及細(xì)微結(jié)構(gòu)的觀察。因此，是微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞和組織培養(yǎng)、細(xì)胞工程、雜交瘤技術(shù)等現(xiàn)代生物學(xué)研究的必備工具。

2、操作步驟 

（1）根據(jù)觀察標(biāo)本的性質(zhì)及要求，挑選適合的相差物鏡。

（2）將標(biāo)本片放到載物臺上。

（3）進(jìn)行光軸中心的調(diào)整。

（4）取下一側(cè)目鏡，換上合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡，調(diào)整環(huán)狀光闌與相板上的共軛面圓環(huán)完全重疊吻合，然后取下合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡，換回目鏡。在使用中，如需要更換物鏡倍數(shù)時，必須重新進(jìn)行環(huán)狀光闌與相板共軛面圓環(huán)吻合的調(diào)整。

（5）放上綠色濾光片，即可進(jìn)行鏡檢，鏡檢操作與普通光學(xué)顯微鏡方法相同。

3、注意事項

（1）視場光闌與聚光器的孔徑光闌必須全部開大，而且光源要強(qiáng)。因環(huán)狀光闌遮掉大部分光，物鏡相板上共軛面又吸收大部分光。

（2）不同型號的光學(xué)部件不能互換使用。

（3）載玻片、蓋玻片的厚度應(yīng)遵循標(biāo)準(zhǔn)，不能過薄或過厚。

（4）切片不能太厚，一般以5—10μm為宜，否則會引起其他光學(xué)現(xiàn)象，影響成像質(zhì)量。