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軍團(tuán)菌是一種在自然界中很常見的細(xì)菌，可以引起以發(fā)熱和肺炎。是潛伏在我們身邊的“殺手”，它的部分癥狀和新冠肺炎較相似，且易發(fā)展為重癥，病死率為5%～30%。軍團(tuán)菌侵入人體后，進(jìn)攻兇猛，7天內(nèi)就可導(dǎo)致患者死亡，患者死亡大都因?yàn)楹粑ソ�，其次為休克和急性腎功能衰竭等。
軍團(tuán)菌病主要的感染途徑是人吸入被污染的氣溶膠。
氣溶膠來源包括空調(diào)冷卻塔、冷熱水系統(tǒng)、加濕器、溫泉等。感染可通過吸入受污染的氣溶膠而發(fā)生，特別是易感的住院病人。大多數(shù)健康人群感染軍團(tuán)菌后，表現(xiàn)為無癥狀或癥狀很輕的一過性感染，50歲以上人群、吸煙者、以及有慢性肺部疾病、免疫功能低下、腫瘤、基礎(chǔ)疾病等人群感染后發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較高。軍團(tuán)菌病潛伏期一般為2-10天。一旦患病，病情常較嚴(yán)重。如治療延遲或治療不當(dāng)，其病死率可高達(dá)15%-20%。軍團(tuán)菌病患者可采用紅霉素、阿奇霉素等抗生素進(jìn)行治療。
目前空調(diào)冷卻水、噴泉水等非飲用水中軍團(tuán)菌污染問題已引起各國(guó)研究者的廣泛關(guān)注，而飲用水中軍團(tuán)菌污染的相關(guān)研究較少。但近年來飲用水系統(tǒng)被軍團(tuán)菌污染事件時(shí)有發(fā)生，特別是2020年受新冠疫情的影響，多數(shù)建筑長(zhǎng)期封閉導(dǎo)致供水系統(tǒng)長(zhǎng)時(shí)間水流停滯，為軍團(tuán)菌的生長(zhǎng)繁殖提供有利條件。
我國(guó)原衛(wèi)生部于2006年頒布了《公共場(chǎng)所集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)衛(wèi)生規(guī)范》的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)，各級(jí)疾控部門和監(jiān)督部門相繼開展了公共場(chǎng)所集中空調(diào)嗜肺軍團(tuán)菌的監(jiān)測(cè)、評(píng)價(jià)和調(diào)查工作。2013年，中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《公共場(chǎng)所衛(wèi)生檢驗(yàn)方法》(GB/T 18204.5—2013)出臺(tái)，其中，第5部分介紹了集中空調(diào)冷凝水、冷卻水中嗜肺軍團(tuán)菌的檢測(cè)方法。上述行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)集中空調(diào)冷凝水、冷卻水中嗜肺軍團(tuán)菌的檢測(cè)方法基本相同，且與歐美等國(guó)家監(jiān)測(cè)方法相似，即通過對(duì)集中空調(diào)冷凝水、冷卻水進(jìn)行過濾、洗脫、酸處理、熱處理后進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。分離培養(yǎng)法是目前國(guó)際通用檢測(cè)軍團(tuán)菌的“金標(biāo)準(zhǔn)”，適用于各種環(huán)境水體。
近些年出現(xiàn)了多種新的嗜肺軍團(tuán)菌定量檢測(cè)方法。其中，酶底物法作為一種同時(shí)適用于飲用水和非飲用水的嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)方法備受關(guān)注。酶底物法作為嗜肺軍團(tuán)菌定量檢測(cè)方法，是嗜肺軍團(tuán)菌利用酶底物試劑中氨基酸、維生素和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)迅速生長(zhǎng)和增殖，其代謝產(chǎn)物與試劑發(fā)生反應(yīng)使溶液顯褐色，基于最可能數(shù)(most probable number，MPN)方法對(duì)樣本中嗜肺軍團(tuán)菌進(jìn)行定量分析。
今天我們先學(xué)習(xí)一下國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《公共場(chǎng)所衛(wèi)生檢驗(yàn)方法》(GB/T 18204.5—2013)中空調(diào)冷卻水、冷凝水中嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)方法：
一
原理
樣品經(jīng)培養(yǎng)在 GVPC 瓊脂平板上生成典型菌落，并在 BCYE 瓊脂平板上生長(zhǎng)而在 BCYE-CYE 瓊脂平板不生長(zhǎng)，進(jìn)一步經(jīng)生化實(shí)驗(yàn)和血清學(xué)實(shí)驗(yàn)鑒定確認(rèn)的菌落為嗜肺軍團(tuán)菌。
二
儀器設(shè)備
2.1.平皿：90mm。
2.2.CO2 培養(yǎng)箱：35℃ ~37℃
2.3.紫外燈:波長(zhǎng)360nm士2nn.
2.4.濾膜過濾器
2.5.濾膜：孔徑 0.22μm~0.45μm。
2.6.真空泵
2.7.離心機(jī)
2.8.渦旋振蕩器
2.9.普通光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡
2.10.水浴箱
2.11.廣口采樣瓶：玻璃或聚乙烯材料，磨口，容積 500 mL。
三
試劑和培養(yǎng)基
3.1.GVPC瓊脂平板
3.2.BCYE瓊脂平板
3.3.BCYE-CYE瓊脂平板
3.4.革蘭氏染色液
3.5.馬尿酸鹽生化反應(yīng)管
3.6.軍團(tuán)菌分型血清試劑
3.7.硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液[c(Na2S203)-- 0.1 mol/L]
四
采樣
4.1將采樣廣口瓶(2.11) 用前滅菌。
4.2每瓶中加人Na2S2O3(c =0.l mol/L)0.3 mL~0.5 mL,中和樣品中的氧化物。
4.3水樣采集位置：冷卻水采樣點(diǎn)設(shè)置在距塔壁20cm、液面下10cm 處，冷凝水采樣點(diǎn)設(shè)置在排水管或冷凝水盤處。
4.4 每個(gè)采樣點(diǎn)依無菌操作取水樣約 500 mL。
4.5 采集的樣品 2d 內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，不必冷凍，但要避光和防止受熱，室溫下貯存不應(yīng)超過 15d。
五
檢驗(yàn)步驟
5.1樣品的沉淀或離心:如有雜質(zhì)可靜置沉淀或1000 r/min離心lmin去除。
5.2樣品的過濾:將經(jīng)沉淀或離心的樣品通過濾膜(2.5)過濾,取下濾膜置于15mL滅菌水中,充分洗脫﹐備用。
5.3樣品的熱處理:取1 mL洗脫樣品﹐置50℃水浴(2.10)加熱30min。
5.4樣品的酸處理:取5 mL洗脫樣品,調(diào)pH至2.2,輕輕搖勻,放置5 min。
5.5樣品的接種:取洗脫樣品(5.2),熱處理樣品(5.3)及酸處理樣品(5.4)各0.l mL,分別接種GVPC平板。
5.6樣品的培養(yǎng):將接種平板靜置于CO2培養(yǎng)箱(2.2)中,溫度為35℃~37℃,CO2濃度為2.5%。無CO2培養(yǎng)箱可采用燭缸培養(yǎng)法。觀察到有培養(yǎng)物生成時(shí),反轉(zhuǎn)平板,孵育10d,注意保濕。
5.7菌落觀察:軍團(tuán)菌生長(zhǎng)緩慢,易被其他菌掩蓋﹐從孵育第3d開始每天在顯微鏡(2.9)上觀察。軍團(tuán)菌的菌落顏色多樣,通常呈白色、灰色、藍(lán)色或紫色﹐也能顯深褐色、灰綠色、深紅色;菌落整齊,表面光滑﹐呈典型毛玻璃狀,在紫外燈下,部分菌落有熒光。
5.8菌落驗(yàn)證:從平皿上挑取個(gè)可疑菌落﹐接種BCYE瓊脂平板和BCYE-CYE瓊脂平板,35 ℃~37℃培養(yǎng)2 d,凡在BCYE瓊脂平板上生長(zhǎng)而在BCYE-CYE瓊脂平板上不生長(zhǎng)的則為軍團(tuán)菌菌落。
5.9菌型確定:應(yīng)進(jìn)行生化培養(yǎng)與血清學(xué)實(shí)驗(yàn)確定嗜肺軍團(tuán)菌。生化培養(yǎng):氧化酶(一/弱＋),硝酸鹽還原(一),尿素酶(一),明膠液化(＋),水解馬尿酸。血清學(xué)實(shí)驗(yàn):用嗜肺軍團(tuán)菌診斷血清進(jìn)行分型。
