1.樣品均質(zhì)和系列稀釋必須保證均勻

MPN法樣品均質(zhì)和稀釋液混勻非常重要。MPN法的兩點假設(shè)之一是“微生物在完全混勻的稀釋液里隨機(jī)分布”�；靹虿怀浞�，就滿足不了MPN法統(tǒng)計的基礎(chǔ)，從而不能獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。

2.試管各稀釋度接種完全

通常，實驗室按照3管接種系統(tǒng)來進(jìn)行MPN檢測，即每個稀釋度接種3管。然而，往往由于樣品中細(xì)菌數(shù)量比較低，陽性管數(shù)很少，很多檢測人員為圖省事僅接種前2個稀釋度。這種做法是十分錯誤的，僅按照前兩個稀釋度的結(jié)果是沒法獲得MPN結(jié)果的。3個稀釋度中，低的稀釋度并不一定比高的稀釋度陽性管數(shù)多。不管前2個稀釋度的結(jié)果如何， 一個稀釋度的結(jié)果都是沒法預(yù)測的。因此，在實際工作中，即便預(yù)先估計樣品中細(xì)菌濃度很低， 9支試管也必須全部接種。

另外，要盡可能多接種幾個稀釋度，杜絕出現(xiàn)全部稀釋度都為陽性的情況，最好能保證結(jié)果中包含全陽性或全陰性的稀釋度。

3.對接種量和培養(yǎng)基量需要正確理解

接種量是MPN法成功與否的關(guān)鍵，一方面接種量要適當(dāng)以便于出現(xiàn)全陽性和全陰性的稀釋度，另一方面接種量必須準(zhǔn)確。MPN表和MPN計算公式都是和接種量密切相關(guān)的。而培養(yǎng)基的體積是多少并不重要，只要接種后培養(yǎng)基濃度接近正常濃度(單倍濃度)就可以了。通常接種稀釋液的體積是1 mL,這個體積必須準(zhǔn)確，而培養(yǎng)基的量是10 mL還是9mL都無所謂。常有人將MPN接種與平板計數(shù)稀釋混淆，以為必需1 mL稀釋液接種到9 mL培養(yǎng)基中。

4.確證后的試管才能計做陽性管

有的MPN法需要多步才能完成可疑菌的確證。只有最終確定為陽性的管才能計數(shù)為陽性管。如果沒有完成確證步驟，把中間步驟的陽性管計做陽性，就會獲得偏高的檢測結(jié)果。

5.正確理解MPN計數(shù)的檢測限和精密度

MPN表中最低結(jié)果通常表示為“<3/g( mL)"或“<30/100 g(mL)",因此很多檢測人員認(rèn)為MPN法的最高檢測限只能達(dá)到“3/g(mL)"或“30/ 100 g(mL)" 。

只要調(diào)整接種的樣品量， MPN法可以檢測任何濃度的樣品。例如， 3管法按等體積接種雙料肉湯，就能將固體樣品的檢測限提高到“0.3/g"。但是， MPN法是根據(jù)概率估計去推算結(jié)果，與平板計數(shù)直接計數(shù)法比起來結(jié)果的精密度要差一些。因此，實際工作中MPN法常用于污染水平低的樣品的檢測，污染水平低的樣品靠平板計數(shù)等直接計數(shù)方法是不易檢測的，尤其是對于固體樣品污染水平低于10 CFU/g時。

調(diào)整接種的樣品量還可以采取提高每個稀釋度的管數(shù)的方法，還能提高MPN法的精密度，獲得和平板計數(shù)相當(dāng)(每個稀釋度接種10管)甚至更高的精密度(每個稀釋度接種10管以上).由于增加每個稀釋度的管數(shù)導(dǎo)致工作量急劇增加，因此這種做法一般都采用單稀釋度接種系統(tǒng)，用來檢測低濃度的樣品。

6.陽性管數(shù)組合檢索不到的情況處理

有的檢測人員檢索MPN表時發(fā)現(xiàn)，有的陽性管數(shù)組合檢索不到，例如，"0-0-3",遇到這種情況不知該如何處理。

在以前的MPN法檢測標(biāo)準(zhǔn)里， MPN表中包含所有的陽性管數(shù)組合(3管法包括4x4 x4=64組),甚至包括“0-0-3"這樣幾乎不可能出現(xiàn)的組合。事實上，我們應(yīng)該對這種結(jié)果持高度懷疑態(tài)度，應(yīng)棄用這種結(jié)果，重新檢測。因此，在新的MPN法檢測標(biāo)準(zhǔn)里去掉了這些幾乎不可能出現(xiàn)的組合。例如， GB 4789.3-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 大腸菌群計數(shù)》僅包括40組陽性管數(shù)組合。

7. MPN值需要正確理解

MPN值是基于統(tǒng)計的估計結(jié)果， MPN值是可能性最大的一個估計值，其95%置信區(qū)間有95%的可能包括真實結(jié)果。結(jié)果報告的MPN值要結(jié)合95%置信限來理解， MPN結(jié)果實際上是一個結(jié)果分布。

以下面一個例子來理解MPN結(jié)果。

【例4-3】 GB 4789.3-2016 中表B. 1接種量0. 1 g、0.01 g和0.001 g對應(yīng)的陽性管數(shù)2、 2、0。產(chǎn)品限值是“<20 MPN/g"。此產(chǎn)品合不合格?

查表得MPN值為“21 MPN/g",其上、下95%置信限分別為“42 MPN/g"和“4.5 MPN/g"。即每克樣品中21個大腸菌群，有95%的可能結(jié)果分布在每克4.5 (下限)個至42個(上限)之間。換句話說，接種量0.1g、0.01 g和 0.001 g對應(yīng)的陽性管數(shù)2、2、0的100次檢測中，有95個結(jié)果在每克4.5個至42個之間，其中每克21個的結(jié)果次數(shù)最多。

MPN結(jié)果是圖4-9中的曲線(以鐘形曲線表示),最可能的結(jié)果是"4.5"和“42"之間的可能性占95%。平板計數(shù)的結(jié)果“20"�？梢钥闯�，由一半稍多的MPN結(jié)果是高于平板計數(shù)結(jié)果的，另外的MPN結(jié)果是低于平板計數(shù)結(jié)果的。因此，無法判斷MPN報告的結(jié)果是否高于平板計數(shù)的結(jié)果。

8.MPN計數(shù)結(jié)果與平板計數(shù)結(jié)果孰高孰低

與平板計數(shù)法相比，有人說MPN計數(shù)偏高，也有人說MPN計數(shù)偏低。其實兩者的高低并不是絕對的，而是與所用的培養(yǎng)基選擇性密切相關(guān)。當(dāng)MPN法的培養(yǎng)基選擇性差，更多的非目標(biāo)菌會被誤當(dāng)作陽性結(jié)果，計數(shù)容易偏高；當(dāng)MPN法的培養(yǎng)基選擇性高，低濃度的目標(biāo)菌生長不起來，計數(shù)就容易偏低。