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本標(biāo)準(zhǔn)與 GB4789.35 2016相比 主要變化如下：
1、增加了實(shí)時(shí)熒光PCR方法為選做方法；
2、修改了乳酸菌的定義、樣品制備、培養(yǎng)時(shí)間;
3、修改了嗜熱鏈球菌和乳桿菌計(jì)數(shù)方法的描述;
4、修改了部分培養(yǎng)基成分、儲(chǔ)備液濃度和制備方法。
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了含乳酸菌食品中乳酸菌(lactic acid bacteria)的檢驗(yàn)方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的檢驗(yàn)。
2014年8月6日國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)公布的《可用于食品的菌種名單》中，還有乳球菌屬和片球菌屬。現(xiàn)在不少乳品生產(chǎn)企業(yè)在發(fā)酵乳產(chǎn)品中添加了這些球菌。因此，進(jìn)行發(fā)酵乳制品的乳酸菌檢驗(yàn)時(shí)，無法避免這兩類球菌造成的干擾。
2.1 乳酸菌lactic acid bacteria
一類可發(fā)酵糖主要產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的通稱,不能液化明膠、不產(chǎn)生咧喋、革蘭氏陽(yáng)性、無運(yùn)動(dòng)、無芽孢、觸酶陰性、硝酸還原酶陰性及細(xì)胞色素氧化酶陰性反應(yīng)的細(xì)菌。本標(biāo)準(zhǔn)中乳酸菌主要為乳桿菌屬(Lactobacillus),雙歧桿菌屬(Bif idobacterium)和嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)。
修改了乳酸菌的定義，增加其生化現(xiàn)象的描述。
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下：
3.1 恒溫培養(yǎng)箱:36℃士1 ℃。
3.2 厭氧培養(yǎng)裝置:厭氧培養(yǎng)箱﹑厭氧罐、厭氧袋或能提供同等厭氧效果的裝置。
3.3 冰箱:2℃~8 ℃。（范圍擴(kuò)大）
3.4 均質(zhì)器及無菌均質(zhì)袋,均質(zhì)杯或滅菌乳缽。
3.5 渦旋混勻儀。
3.6 電子天平:感量0.001 g。（精度升高）
3.7 實(shí)時(shí)定量PCR儀。
3.8 恒溫水浴鍋或金屬浴。
3.9 離心機(jī):離心力≥>10 000×g。
3.10 無菌試管:18 mm×180 mm,15 mm×100 mm。
3.11 無菌吸管: l mL(具 0.0l mL刻度)、10 mL(具 0.1 mI刻度)。
3.12 微量移液器和滅菌吸頭 :2 pL、10 u.L.100 pL200 p.L 1 000 uL。
3.13 無菌錐形瓶:500 mL,250 mL。
3.14 無菌平皿:直徑90 mm。
3.15 PCR管。
1.增加設(shè)備：厭氧裝置、渦旋混勻儀、實(shí)時(shí)定量PCR儀、恒溫水浴鍋或金屬浴、離心機(jī)、微量移液器和滅菌吸頭、無菌平皿、PCR管等；
2.電子天平精度由0.01g改為0.001g；主要是為了保證對(duì)于那些活菌菌種制品的稱量準(zhǔn)確性；
3.冰箱溫度范圍由2℃~5 ℃改為2℃~8 ℃。
4.1 稀釋液:見附錄A中 A.1。（新增）
4.2 MRS(Man Rogosa Sharpe)瓊脂培養(yǎng)基:見附錄A中A.2。
4.3 莫匹羅星鋰鹽(Li Mupirocin)和半胱氨酸鹽酸鹽(Cysteine Hlydrochloride)改良MRS瓊脂培養(yǎng)基:見附錄A中A.3。
4.4 MC培養(yǎng)落( Modified Chalmers 培養(yǎng)基):見附錄A中A.4。
4.5 0.5%蔗糖發(fā)酵管:見附錄A中A.5。
4.6 0.5%纖維二糖發(fā)酵管:見附錄A中A.5。
4.7 0.5%麥芽糖發(fā)酵管:見附錄A中A.5。
4.8 0.5%甘露醇發(fā)酵管:見附錄A中A.5。
4.9 0.5%水楊苷發(fā)酵管:見附錄A中A.5。
4.10 0.5%山梨醇發(fā)酵管:見附錄A中A.5。
4.11 0.5%乳糖發(fā)酵管:見附錄A中A.5。
4.12 七葉苷發(fā)酵管:見附錄A中A.6。
4.13 革蘭氏染色液:見附錄A中A.7。
4.14 生理鹽水:見附錄A 中A.8。
4.15 DNA提取液:見附錄A中 A.9。（新增）
4.16 10xPCR緩沖液:見附錄A中 A.10。（新增）
4.17 莫匹羅星鋰鹽(C26HIx;O,- Li):化學(xué)純。
4.18 半胱氨酸鹽酸鹽(C: I1;ClNO,S):純度99 %。
4.19 dNTPs。（新增）
4.20 Taq DNA聚合酶:5 U/ pL。（新增）
4.21 七種乳酸菌引物探針。（新增）
4.22 滅菌去離子水。（新增）
增加培養(yǎng)基：稀釋液;
針對(duì)現(xiàn)有稀釋液對(duì)某些乳酸菌計(jì)數(shù)結(jié)果偏低等情況，修改了樣品前處理時(shí)所用稀釋液成分和溫度。經(jīng)驗(yàn)證，稀釋液“生理鹽水+1.5%胰蛋白胨（37 ℃預(yù)熱）”在乳酸菌檢驗(yàn)中，計(jì)數(shù)結(jié)果優(yōu)于其它稀釋液；
增加實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)用試劑:DNA提取液、10xPCR緩沖液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、七種乳酸菌引物探針、滅菌去離子水等；
1.檢驗(yàn)程序主要修改點(diǎn)為增加乳桿菌計(jì)數(shù)。
6.1 樣品制備
6.1.1 樣品的全部制備過程均應(yīng)遵循無菌操作程序。
6.1.2 稀釋液在試驗(yàn)前應(yīng)在36℃士1 ℃條件下充分預(yù)熱15 min~30 min。
6.1.3 冷凍樣品可先使其在2℃~5℃條件下解凍，時(shí)間不超過18h,也可在溫度不超過45℃的條件解凍,時(shí)間不超過15min。
6.1.4 固體和半固體樣品:以無菌操作稱取25g樣品,置于裝有225 mL稀釋液的無菌均質(zhì)杯內(nèi),于8 000×g ~10 000×g 均質(zhì)l min~2 min,制成1∶10樣品勻液;或置于225 mL稀釋液的無菌均質(zhì)袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打l min~-2 min制成l∶10 的樣品勻液。
6.1.5 液體樣品:液體樣品應(yīng)先將其充分搖勻后以無菌吸管吸取樣品25 mL放入裝有225 mL稀釋液的無菌錐形瓶(瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)或均質(zhì)袋中,充分振搖或拍擊式均質(zhì)器拍打l min~2 min,制成1 ∶10的樣品勻液。
6.1.6 經(jīng)特殊技術(shù)(如包埋技術(shù))處理的含乳酸菌食品樣品應(yīng)在相應(yīng)技術(shù)/工藝要求下進(jìn)行有效前處理。
1.增加稀釋液預(yù)熱的操作；
2.增加特除技術(shù)處理的乳酸菌食品樣品的前處理要求；
3.液體樣品處理增加拍打均質(zhì)器的操作。
6.2 稀釋及培養(yǎng)
6.2.1 用l mL無菌吸管或微量移液器吸取1∶10樣品勻液l mL,沿管壁緩慢注于裝有9 mL稀釋液的無菌試管巾(注意吸管或微量移液器吸頭尖端不要觸及稀釋液),振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻,制成1∶100 的樣品勻液。
6.2.2 另取l mL無菌吸管或微量移液器吸頭,按上述操作順序,做10倍遞增樣品勻液,每遞增稀釋一次,即換用1次l mL滅菌吸管或吸頭。
6.2.3 經(jīng)特殊技術(shù)(如包埋技術(shù))處理的含乳酸菌食品應(yīng)按照相應(yīng)技術(shù)/工藝要求進(jìn)行稀釋。（新增）
6.3乳酸菌計(jì)數(shù)
6.3.1 乳酸菌總數(shù)
乳酸菌總數(shù)計(jì)數(shù)培養(yǎng)條件的選擇及結(jié)果說明見表1。
6.3.2 雙歧桿菌計(jì)數(shù)
根據(jù)對(duì)待檢樣品雙歧桿菌含量的估計(jì),選擇2個(gè)~3個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度,每個(gè)稀釋度吸取1mL樣品勻液于滅菌平皿內(nèi),每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。稀釋液移入平皿后,將冷卻至48 ℃~50 ℃的莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽改良MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注入平皿15 mL~20 mL,轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使混合均勻。培養(yǎng)基凝固后倒置于36 ℃士1℃厭氧培養(yǎng),根據(jù)雙歧桿菌生長(zhǎng)特性，一般選擇培養(yǎng)48 h,若菌落無生長(zhǎng)或生長(zhǎng)較小可選擇培養(yǎng)至72 h,培養(yǎng)后計(jì)數(shù)平板上的所有菌落數(shù)。從樣品稀釋到平板傾注要求在15 min內(nèi)完成。
6.3.3嗜熱鏈球菌計(jì)數(shù)
根據(jù)待檢樣品嗜熱鏈球菌活菌數(shù)的估計(jì),選擇2個(gè)~3個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度,每個(gè)稀釋度吸取1mL樣品勻液于滅菌平皿內(nèi),每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。稀釋液移入平皿后,將冷卻至48℃~50 ℃的MC瓊脂培養(yǎng)基及時(shí)傾注入平皿15 mL~20 mL,轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使混合均勻。培養(yǎng)基凝固后倒置于36 ℃土1℃有氧培養(yǎng),根據(jù)嗜熱鏈球菌生長(zhǎng)特性,一般選擇培養(yǎng)48 h,若菌落無生長(zhǎng)或生長(zhǎng)較小可選擇培養(yǎng)至72 h。嗜熱鏈球菌在MC瓊脂培養(yǎng)基平板上的菌落特征為:菌落中等偏小,邊緣整齊光滑的紅色菌落，直徑2 mm士l mm,菌落背面為粉紅色。從樣品稀釋到平板傾注要求在15 min內(nèi)完成。
6.3.4 乳桿菌計(jì)數(shù)
根據(jù)待檢樣品活菌總數(shù)的估計(jì),選擇2個(gè)~3個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度,每個(gè)稀釋度吸取1 mL樣品勻液于滅菌平皿內(nèi),每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。稀釋液移入平皿后,將冷卻至48 ℃~50 ℃的MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注入平皿15 mL~20 mL,轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使混合均勻。培養(yǎng)基凝固后倒置于36℃士1℃厭氧培養(yǎng),根據(jù)乳桿菌生長(zhǎng)特性，一般選擇培養(yǎng)48 h,若菌落無生長(zhǎng)或生長(zhǎng)較小可選擇培養(yǎng)至72 h。從樣品稀釋到平板傾注要求在15 min內(nèi)完成。
1.修改了文字描述；
2.培養(yǎng)基溫度和傾注的培養(yǎng)基的量均改為了一定的范圍；
3.培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)培養(yǎng)生長(zhǎng)特性可以培養(yǎng)48h至72 h。
6.4菌落計(jì)數(shù)
見GB 4789.2菌落計(jì)數(shù)部分。
6.5結(jié)果的表述
見GB 4789.2計(jì)算方法部分。
6.6菌落數(shù)的報(bào)告
見 GB 4789.2菌落總數(shù)的報(bào)告部分。
7.結(jié)果與報(bào)告
根據(jù)菌落計(jì)數(shù)結(jié)果出具報(bào)告,報(bào)告單位以CFU/g(mL)表示。
8. 乳酸菌的鑒定(可選做)
8.1 第一法 生化鑒定
8.1.純培養(yǎng)
挑取3個(gè)或以上單菌落,嗜熱鏈球菌接種于MC瓊脂平板,置36℃士1℃有氧培養(yǎng)48 h,乳桿菌屬接種于MRS瓊脂平板,置36℃士1℃厭氧培養(yǎng)48 h。
8.1.2 雙歧桿菌的鑒定
按GB 4789.34的規(guī)定操作。
8.1.3 涂片鏡檢:
嗜熱鏈球菌菌體鏡下呈球形或球桿狀,直徑為0.5 um~2.0 um,成對(duì)或成鏈排列,無芽孢,革蘭氏染色陽(yáng)性。乳桿菌屬鏡下菌體形態(tài)多樣,呈長(zhǎng)桿狀.彎曲桿狀或短桿狀,無芽孢,革蘭氏染色陽(yáng)性。
1.修改了文字描述，強(qiáng)調(diào)形態(tài)是在鏡下的；
8.1.4 乳酸菌種主要生化反應(yīng)
乳酸菌種主要生化反應(yīng)見表2和表3。
8.2.1純培養(yǎng)
同8.1.1。
8.2.2DNA模板制備
使用接種環(huán)刮取 MC瓊脂平板或MRS瓊脂平板上的菌落2個(gè)~10個(gè),懸浮于200uL滅菌生理鹽水中,充分混勻,10 000×g ~12 000×g 離心3 min,棄去上清。加入50uLDNA提取液渦旋混勻,置于100℃水浴或者金屬浴中10 min后迅速冷卻,10 000×g~12 000×g離心3 min。吸取上清液至新的PCR反應(yīng)管內(nèi),作為DNA模板使用。提取后的DNA模板應(yīng)置于4℃供當(dāng)天使用,否則應(yīng)于-20℃以下保存,并于1周內(nèi)使用。
注:根據(jù)實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況﹐也可用商品化試劑盒制備DNA模板。
8.2.3 PCR反應(yīng)體系
總反應(yīng)體系體積為25 uL:10× PCR緩沖液2.5 uL、上下游引物(10 umol/L)各l uL、探針(10 umol/L)0.5 pL,dNTPs(2.5 umol /L)3uL、Taq DNA聚合酶(5 U/uL)0.5uL,模板DNA 1uL、滅菌去離子水補(bǔ)足至25uL。每個(gè)反應(yīng)均應(yīng)設(shè)置至少2個(gè)平行。
注:反應(yīng)體系中各試劑的量可根據(jù)具體情況或不同的反應(yīng)總休積進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。亦可選用含有PCR級(jí)沖液、MgCl2 ,dNTP和Taq酶等成分基于Taqman探針的實(shí)時(shí)熒光PCR預(yù)混液。
8.2.4 PCR反應(yīng)條件
50 ℃ 5 min,95℃預(yù)變性3 min,94 ℃變性5s,60 ℃退火延伸40 s(同時(shí)收集FAM熒光),進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。
注:PCR反應(yīng)參數(shù)可根據(jù)基因擴(kuò)增儀型號(hào)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。
鑒定用引物和探針序列見表4。
8.2.5對(duì)照設(shè)置
檢測(cè)過程(包括DNA提取)中,每個(gè)反應(yīng)均應(yīng)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。其中陽(yáng)性對(duì)照模板為擴(kuò)增片段的陽(yáng)性克隆分子DNA或陽(yáng)性菌株 DNA,陰性對(duì)照模板為非乳酸菌菌株 DNA,空白對(duì)照模板為無菌水。
8.2.6結(jié)果判讀
8.2.6.1對(duì)照的結(jié)果判讀
陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線,Ct≤30;陰性對(duì)照無典型擴(kuò)增曲線或Ct≥40;空白對(duì)照無典型擴(kuò)增曲線或Ct≥40。否則,結(jié)果視為無效。
8.2.6.2樣品的結(jié)果判讀
當(dāng)樣品檢測(cè)Ct≥40時(shí),判定樣品結(jié)果為某種乳酸菌陰性;當(dāng)檢測(cè)Ct≤35,可判定該樣品結(jié)果為某種乳酸菌陽(yáng)性;當(dāng)檢測(cè)35<ct<40時(shí),重復(fù)試驗(yàn),若重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)ct≥40,則判定為某種乳酸菌陰性，否則,判定為某種乳酸菌陽(yáng)性。< span=""></ct<40時(shí),重復(fù)試驗(yàn),若重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)ct≥40,則判定為某種乳酸菌陰性，否則,判定為某種乳酸菌陽(yáng)性。
