2、培養(yǎng)基

改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基:用于黑曲霉復蘇、復壯.
液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基:用于生孢梭菌復蘇、復壯.
營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基:用于金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、短小芽孢桿菌、銅綠假單胞菌復蘇、復壯。
改良馬丁培養(yǎng)基:用于白色念珠菌復蘇、復壯.

3、操作步驟：

a.打開潔凈工作臺。

b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并讓其自然風干。

c.用一小砂輪在安瓿的上部劃一條線，用手輕輕將安瓿掰開（開啟安瓿時必須小心，因為安瓿遇熱時可能會破裂）。

d.以無菌方法用一無菌吸管從已準備好的上述液體培養(yǎng)基中移取0.5～0.8 ml到安瓿中。

e.輕輕地旋轉(zhuǎn)安瓿以使凍干菌種和液體培養(yǎng)基充分混合并完全溶解。

f.用無菌吸管將安瓿內(nèi)菌液全部轉(zhuǎn)接到相應的液體培養(yǎng)基。

g.根據(jù)安瓿上所標明的不同菌種類型而將其培養(yǎng)于相應的溫度（細菌培養(yǎng)溫度30～35℃，培養(yǎng)18～24小時；真菌培養(yǎng)溫度23～28℃，培養(yǎng)3～5天。觀察是否渾濁，渾濁說明菌種復蘇生長；若不渾濁，細菌應延長培養(yǎng)時間至7天，真菌應延長培養(yǎng)時間至14天，若仍未渾濁，滅菌處理。

h.黑曲霉的菌懸液先室溫待菌懸液融化后用無菌吸管吸取管內(nèi)液體1～2滴滴在改良馬丁瓊脂斜面上，用吸管涂布均勻，置23～28℃培養(yǎng)5～7天，斜面正面為黑褐色厚絨狀，色澤均一，不應有雜色，斜面?zhèn)让鏌o色，接近菌層培養(yǎng)基略帶黃色。確認后用含有0.05%（ml/ml）的吐溫-80的0.9%無菌氯化鈉溶液洗脫到無菌試管中。

i.取經(jīng)復蘇后的上述細菌菌液8-10ml至液體培養(yǎng)基中按g項操作對菌種進行復壯。以無菌技術(shù)向復壯后的菌種中加入100ml20%的無菌甘油混勻，1-2ml/管分裝于凍存管。每個菌種制備10支，按順序進行編號，最后一支做為質(zhì)控管進行質(zhì)量控制，即進行相應的確認。其余作為儲備管。黑曲霉的h項下洗脫液按h項下方法進行復壯，制成復壯后的孢子懸液20ml。以無菌技術(shù)向復壯后的菌種中加入20ml 、30%的無菌甘油混勻，1-2ml/管封存于凍存管。制備10支，按順序進行編號，最后一支做為質(zhì)控管進行質(zhì)量控制，即進行相應的確認。其余作為儲備管。將上述制備好的凍存管逐支粘貼標簽。內(nèi)容包括：菌種名稱、菌種代號、編號、代次、制備日期、制備人、貯存條件、有效期至等。

j．儲備菌種管制備成功，儲存于－20℃，有效期為三年。

4、菌種確認

用無菌接種環(huán)從質(zhì)控管中取細菌培養(yǎng)物接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，或相應的宜于該細菌生長的鑒別平板上，劃線分離出單個菌落。然后在30～35℃下培養(yǎng)2～3天；同樣的方法取真菌到玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板，并在23～28℃下培養(yǎng)7天；培養(yǎng)后，觀察其菌落形態(tài)，應符合該菌種形態(tài)特征。

5、污染處理

假如在該平板上發(fā)現(xiàn)有其他菌落生長，則說明或操作有污染或菌種不純。將此被污染了的培養(yǎng)物滅菌處理�？蓪ふ以�因重新分離挑選純菌落轉(zhuǎn)接斜面菌種作為第四代。并重新制備儲備菌種管

6、菌種的傳代與保藏

將菌種接種至一新鮮培養(yǎng)基上，每萌發(fā)一次即稱為一代，因此，當原始菌種復溶并轉(zhuǎn)至新培養(yǎng)基內(nèi)生長，即認為已傳代一次，從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥的菌種為第0代，冷凍干燥的原始菌種開啟后轉(zhuǎn)種后為第1代，直到第3代為工作菌種。菌種的傳代次數(shù)（自原始菌種凍干粉起）不得超過5代。

菌種的傳代保藏過程

3項下標準菌的復蘇為傳第一代，復壯為第二代。 傳第三代時取1支凍存管自然解凍，將其轉(zhuǎn)接斜面菌種作為工作用菌種。此時，工作用菌種為第3代。工作用菌種，分為兩類：一類用于定期傳代(W3)，一類用于實驗用（S3）。

定期傳代用菌的傳代其操作步驟如下（斜面接種法）：

（1）從冰箱冷藏室中取出菌種斜面后，應在室溫放置約30分鐘。

（2）將裝有新鮮配制的培養(yǎng)基菌種保藏管管壁上注明菌名及接種日期，和傳代菌種一并移入潔凈工作臺，打開紫外燈照射一小時。

（3）關(guān)閉紫外燈。點燃酒精燈，左手握住菌種斜面，將管口靠近火焰上方，右手拿接種棒后端，將接種環(huán)燒紅約30秒，隨后將接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返通過三次。

（4）右手用無名指、小指及掌部夾住管塞，左手將管口在火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼，右手再輕輕拔開管塞，將接種環(huán)伸入管內(nèi)先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少量菌苔，隨即取出接種棒并將菌種管口移至火焰上方�！�

（5）塞上管塞，左手將菌種管放下，取營養(yǎng)瓊脂斜面（或改良馬丁瓊脂斜面）一支，照上述操作打開管塞，將接種環(huán)伸入管內(nèi)至瓊脂斜面的底部向上劃一條直線，然后從底部向上作連續(xù)曲線劃線，一直劃到斜面頂端，使細菌接種在斜面的表面上。

（6）取出接種環(huán)，在火焰上方將培養(yǎng)基管蓋上塞子，然后將接種過細菌的接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌。

（7）將已接種好的細菌管置30～35℃細菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)22 ～24h，真菌管置23～28℃真菌培養(yǎng)箱最多培養(yǎng)7天。

當工作用菌種傳代代數(shù)小于5時，可直接用上一代工作用菌種轉(zhuǎn)接下一代工作用菌種，如：（W3）可直接轉(zhuǎn)接為（W4）。按上述程序操作，直至（W4）轉(zhuǎn)為（W5）為止，需重新接種，舊的工作菌種進行銷毀。