從混雜微生物群獲得純培養(yǎng)物對微生物學研究至關重要。

純培養(yǎng)物是指來源于同一單細胞的細胞群體。

從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物分離與純化。在分子生物學的研究及應用中，不僅需要通過分離純化技術從混雜的天然微生物群中分離出特定的微生物，而且還必須隨時注意保持微生物純培養(yǎng)物的“純潔”，防止其他微生物的混入。

平板涂布法

因為將微生物懸液先加到較燙的培養(yǎng)基中再倒平板易造成某些熱敏感菌的死亡，且采用稀釋倒平板法也會使一些嚴格好氧菌因被固定在瓊脂中間缺乏氧氣而影響其生長，因此在微生物學研究中常用的純種分離方法是涂布平板法。

用途：一般多用于從菌種的純化；

優(yōu)點：可以觀察菌落特征，對混合菌進行分離；

缺點：不能計數(shù)；

平板劃線法

最簡單的分離微生物的方法是平板劃線法，其原理是將微生物樣品在固體培養(yǎng)基表面多次作“由點到線”稀釋而達到分離目的的。劃線的方法很多，常見的比較容易出現(xiàn)單個菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。

用途：一般多用于篩選菌株。一般用于平板培養(yǎng)基的回收率計數(shù)。 

優(yōu)點：可以計數(shù)，可以觀察菌落特征。 

缺點：吸收量較少，較麻煩，平板不干燥效果不好，容易蔓延。如果菌液密度大的話，長不出單菌落。

大腸菌群能在乳糖膽鹽液體培養(yǎng)液中生長，并且產(chǎn)氣產(chǎn)酸，使培養(yǎng)液變色。還能在伊紅美蘭固體培養(yǎng)上生長，形成黑紫色的菌落，有的還有金屬光澤。其他病原菌的菌落呈粉紅色。再做鏡檢觀察是無芽孢的革蘭氏陰性桿菌（呈紅色）。即可鑒定是有大腸菌群的菌存在。

菌種保藏是將微生物的菌種經(jīng)長時間的保存，不污染其它雜菌，及可保持其形態(tài)特征和生理性狀，減少變異，防止衰老，以便于將來使用。保藏菌種一般是選用它的休眠休，如孢子；芽孢等等，并且要創(chuàng)造一個低溫；干燥；缺氧；避光和缺少營養(yǎng)的環(huán)境條件，以利于休眠體能長期地處于休眠狀態(tài)。對于不產(chǎn)孢子的微生物，應使其新陳代謝處于最低狀態(tài)，又不會死亡，從而達到長期保存的目的。

注：

1.乳糖膽鹽液體培養(yǎng)基：由蛋白胨、乳糖、溴甲酚紫和膽鹽組成，屬液態(tài)、鑒別、增值、半合成培養(yǎng)液，實驗中用于廢水中菌群的培養(yǎng)；

2.伊紅美藍瓊脂：含蛋白胨、乳糖、磷酸氫二鉀、伊紅-美藍和瓊脂。瓊脂平板用于分離純化腸道致病菌，特別是大腸菌群和糞大腸菌群；

3.營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：含牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉和瓊脂。用于分離純化后的菌體培養(yǎng)。

1.實驗安排

實驗準備；

采樣、恒溫培養(yǎng)富集及初篩；

觀察產(chǎn)氣情況及稀釋、倒培養(yǎng)基、劃線、涂布、倒置培養(yǎng)；

鑒定、接種；

菌種保藏。

2.具體操作步驟

實驗準備

①配置培養(yǎng)基(伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基：7.4g+200mL無菌水、調(diào)pH7.2～7.4，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：6.6g+200mL無菌水、調(diào)pH7.4±0.2,0.85%生理鹽水、乳糖膽鹽液體培養(yǎng)基2.6g+100mL無菌水，調(diào)pH7.4±0.2),，裝瓶，高壓蒸汽滅菌。

②包扎好培養(yǎng)皿，移液管，試管，進行干熱滅菌。

③將配好的乳糖膽鹽液體培養(yǎng)基分裝入三個試管中，每個大約十毫升，包扎，滅菌。

④液體石蠟和涂布棒等其他實驗玻璃器進行滅菌。

 采樣、培養(yǎng)

取水，湖水，廢水三樣約2～3滴于3支已滅菌的乳糖膽鹽液體培養(yǎng)基試管中，貼好標簽（采樣時間、人物、溫度，采樣地點及天氣情況），塞好棉塞，于恒溫箱（37℃）培養(yǎng)18～24小時；

觀察產(chǎn)氣情況、稀釋

①觀察產(chǎn)氣管有無氣柱，標記陽性管數(shù)。

②樣品稀釋：

對已滅菌的5只試管編號（分別為1、2、3、4、5號），從樣液試管取1mL樣品液放入盛有9mL生理鹽水的試管中為1號試管，換一只移液管，按上述方法依次配置5份10倍系列稀釋液。貼明標簽。

劃線、涂布

①涂布平板法：

將已熔化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌平皿，制成無菌平板，冷卻凝固后，將一定量的含大腸菌群的污水滴加在平板表面，再用無菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個平板表面，置培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24小時。經(jīng)培養(yǎng)后挑取單個菌落。

※涂布平板法操作：

1.取少量菌液（不超過0.1ml），滴加到培養(yǎng)基表面；

2.用滅菌過的涂布棒或一次性涂布棒將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時可轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使涂布均勻。

注意：

1.將涂布器末端浸在盛有體積分數(shù)為70%的酒精的燒杯中。取出時，要讓多余的酒精在燒杯中滴盡，然后將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。

2.操作中一定要注意防火！不要將過熱的涂布器放在盛放酒精的燒杯中，以免引燃其中的酒精。）

②平板劃線法：

經(jīng)培養(yǎng)后挑取單個菌落，接種環(huán)以無菌操作沾取少許菌落，在無菌伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基平板表面進行連續(xù)劃線，微生物細胞數(shù)量將隨著劃線次數(shù)的增加而減少，并逐步分散開來，如果劃線適宜的話，微生物能一一分散。在37℃經(jīng)培養(yǎng)24小時后，可在平板表面得到單菌落。（有時這種單菌落并非都由單個細胞繁殖而來的，故必須反復分離多次才可得到純種。）

平板劃線操作：

鑒定

觀察EMB平板，菌落呈紫黑色，具有或略有金屬光澤，或者呈淡紫紅色，僅中心顏色較深，選取符合上述特征的單個菌落進行革蘭氏染色，鏡檢（油鏡）觀察是否為無芽孢的革蘭氏陰性短桿菌。

培養(yǎng)

a.將菌落轉(zhuǎn)入裝有玻璃珠的滅菌錐形瓶中調(diào)節(jié)酸堿度為7，充分搖勻備用。

b.液體發(fā)酵：取處理好的樣品液1mL加入滅菌的乳糖膽鹽液體培養(yǎng)基中。搖勻后置培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24小時

菌種保藏

①斜面低溫保藏法：

此法為最常用的一種。一般霉菌；放線菌和有芽孢的細菌可保存2～4個月，酵母菌可保存2個月，無芽孢的細菌最好每周移接一次。操作過程如下：

a.接種：將要保藏的菌種接入斜面培養(yǎng)基上，試管上貼好標簽，寫上菌種名稱，時間。

b.培養(yǎng)：各類菌按其所需溫度和時間進行培養(yǎng)。

c.保藏：選取生長健壯的菌種，于其試管帶棉塞的上半部用滅菌的塑料包扎好，以防棉塞受潮感染雜菌。置于4℃冰箱中保藏。

②液體石臘保藏法：

此法可用不分解石臘的菌種保藏。保存時間是半年至一年。放線菌；霉菌和產(chǎn)芽孢菌可保藏二年。液體石臘可防止培養(yǎng)基水分的蒸發(fā)，而引起的菌種死亡。同時可阻止氧氣進入，防止好氧菌的生長。從而延長菌種保藏的時間。但需注意的是試管必須直立放置，并且不便攜帶。操作過程如下

a液體石臘的滅菌：將液體石臘裝入錐形瓶中，量不超出錐形瓶體積的1/3，塞上棉塞，包扎好后，進行高壓蒸汽滅菌二次（120℃30分鐘）。再在110～120℃干燥箱中蒸發(fā)掉蒸汽滅菌時帶入的水分。此時石臘透明清亮狀。經(jīng)檢驗確定無菌后備用。

b菌種培養(yǎng)：將所需的菌種經(jīng)培養(yǎng)后，選取健狀的保藏。

c加石臘油：用無菌管吸取石臘油加入菌種試管中，以高出菌種斜面頂點1cm為宜。少了會因培養(yǎng)基露出油面，而使培養(yǎng)基變干造成菌死亡。

d 收藏：試管上部用塑料包扎好，垂直立于冰箱中4℃。

e 恢復使用：當要使用菌種時。傾出石臘油。此石臘油可再滅菌重復使用。接種培養(yǎng)。由于菌體外粘有油。第一次的菌生長緩慢，性狀恢復不是很好。所以要再移植一次才能得到良好的菌種。

1．觀察記錄乳糖膽鹽培養(yǎng)基產(chǎn)氣情況。

2．觀察EMB培養(yǎng)基上菌落（包括：形態(tài)，質(zhì)地，色澤，上述實驗方案中有具體說明。）

3．記錄鏡檢結(jié)果。