標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作要求

一

按GB/T22554-2010《基于標(biāo)準(zhǔn)樣品的線性校準(zhǔn)》推薦：1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍應(yīng)覆蓋正常操作條件下的被測(cè)量范圍；2、標(biāo)準(zhǔn)樣品的組分盡量與被測(cè)樣品組分一致；3、標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度值應(yīng)等距離的分布在被測(cè)量范圍；4、標(biāo)準(zhǔn)樣品的個(gè)數(shù)至少應(yīng)有3個(gè)濃度；5、每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)至少重復(fù)2次，這個(gè)重復(fù)是指從稀釋開始；如果國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)有相應(yīng)的濃度系列推薦，盡量按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，如果你要偷懶，比如我要減少標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，至少要有理論標(biāo)準(zhǔn)支撐，比如至少要3個(gè)濃度。工作中我們經(jīng)常采用線性校準(zhǔn)，因?yàn)榫�性方程最為簡(jiǎn)潔。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的作法

二

(1)標(biāo)準(zhǔn)液濃度的選擇：在制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)液濃度選擇一般應(yīng)能包括待測(cè)樣品的可能變異最低與最高值，一般可選擇5種濃度。濃度差距最好是成倍增加或等級(jí)增加，并應(yīng)與被測(cè)液同樣條件下顯色測(cè)定。

(2)標(biāo)準(zhǔn)液的測(cè)定：在比色時(shí)，讀取光密度至少讀2-3次，求其平均值，以減少儀器不穩(wěn)定而產(chǎn)生的誤差。

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖的繪制：一般常用的是光密度--濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

①用普通方格紙作圖。圖紙最好是正方形(長(zhǎng)：寬=l：1)或長(zhǎng)方形(長(zhǎng)：寬=3 ：2)，以橫軸為濃度，縱軸為光密度，一般濃度的全距占用了多少格，光密度的全距也應(yīng)占用相同的格數(shù)。

在適當(dāng)范圍內(nèi)配制各種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，求其光密度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以濃度位置向上延長(zhǎng)，光密度位置向右延長(zhǎng)、交點(diǎn)即為此座標(biāo)標(biāo)點(diǎn)。然后，將各坐標(biāo)點(diǎn)和原點(diǎn)聯(lián)成一條線，若符合Lambert-Beer氏定律，則系通過原點(diǎn)的直線。

②若各點(diǎn)不在一直線，則可通過原點(diǎn)，盡可能使直線通過更多點(diǎn)，使不在直線上的點(diǎn)盡量均勻地分布在直線的兩邊。

③標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制完畢以后，應(yīng)在座標(biāo)紙上注明實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的名稱，所使用比色計(jì)的型號(hào)和儀器編號(hào)、濾光片號(hào)碼或單色光波長(zhǎng)以及繪制的日期、室溫。

④繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：一般應(yīng)作二次或三次以上的平行測(cè)定，重復(fù)性良好曲線方可應(yīng)用。

⑤繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線只能供以后在相同條件下操作測(cè)定相同物質(zhì)時(shí)使用。當(dāng)更換儀器、移動(dòng)儀器位置、調(diào)換試劑及室溫有明顯改變時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線需重新繪制。

⑥標(biāo)準(zhǔn)曲線橫坐標(biāo)的標(biāo)度：從標(biāo)準(zhǔn)液的含量換算成待測(cè)液的濃度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的核心問題要解決

三

1、能找到確切濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或標(biāo)準(zhǔn)品。

2、標(biāo)準(zhǔn)系列和待測(cè)物質(zhì)一定要有相同和一致的基體，因?yàn)闃悠坊�體可能會(huì)干擾儀器的響應(yīng)，從這個(gè)意義上講，樣品的前處理實(shí)際就是提供標(biāo)準(zhǔn)和樣品同樣的基體環(huán)境，盡量祛除干擾基體。所以最好的標(biāo)準(zhǔn)系列應(yīng)該是樣品基體匹配的標(biāo)準(zhǔn)系列。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作注意事項(xiàng)

四

對(duì)于分析定量來說，如果標(biāo)線沒有做好，那么即使前處理做的再好，回收率再好，也會(huì)使你的結(jié)論失去一定的參考價(jià)值！也失去了與其他人員測(cè)試數(shù)據(jù)的可比性！要做好定量工作除了儀器正常外，我們也要配制好一條好的標(biāo)線：

1.首先盡量選取有證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，不管是直接要用的母液還是要配置成母液的其他物質(zhì)（如固體，粉末等）！選取有證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是為了大家都有一個(gè)共同的基準(zhǔn)（量值溯源）！如果實(shí)在是在沒有有證書的母液條件下，就用有證書的其他物質(zhì)來配置！如果有就最好用有證書的物質(zhì)，因?yàn)樽约号渲玫哪敢簳?huì)帶來一定的誤差！

2.在配置時(shí)要把所有要用到的工具（容量瓶、移液槍、移液管等）進(jìn)行校正，最好拿到國(guó)家計(jì)量中心或有資質(zhì)的部門校正！有校正能力的實(shí)驗(yàn)室也可自己校正！

3.防止污染！要洗凈所要用到的工具！對(duì)于離子色譜來說，主要使用去離子水清洗！

4.配制好標(biāo)液后，及時(shí)上機(jī)，避免有的物質(zhì)不穩(wěn)定或易被污染！

但在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室中也只有常規(guī)分析的時(shí)候，相對(duì)比較容易些，而現(xiàn)目前不少實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目均要求檢測(cè)ppb級(jí)含量的物質(zhì)，IC是很容易引入污染的（Cl、Na等）。跨越幾個(gè)數(shù)量級(jí)時(shí)，線性系數(shù)雖然很好，但是RSD值卻很大，痕量分析的定量誤差是相當(dāng)?shù)拇蟆?/span>

5.選取合適的方程。根據(jù)物質(zhì)的和檢測(cè)器的特性，選取合適的線性方程。（比如是否要強(qiáng)制過原點(diǎn)，是直線還是二次方程等）

6.檢查線性是否合格。除線性本身的一些參數(shù)：RSD值是否小于一定值比如（5%），線性相關(guān)系數(shù)是否達(dá)到比如四個(gè)九以上，如果不是強(qiáng)行過原點(diǎn)的一次方程的節(jié)距是否合理等外，還要檢查濃度的準(zhǔn)確性，因?yàn)橐欢�濃度的母液，按一定比例稀釋都可成一定線性的，但濃度就不一定就是所需要的！所以光看線性好，是不能代表所做的標(biāo)線就是合格的。

7.標(biāo)線的準(zhǔn)確性除儀器自身的回收率、響應(yīng)值等相關(guān)外，另外我們可以做到：

⑴不同的人員配置標(biāo)線和QC；

⑵防止母液是否有問題，要做標(biāo)液的新舊對(duì)比或者不同的牌子的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（參考物質(zhì)）進(jìn)行監(jiān)控和或使用或次級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（參考物質(zhì)）開展內(nèi)部質(zhì)量控制；

⑶參加實(shí)驗(yàn)室間的比對(duì)或能力驗(yàn)證；

⑷使用相同或不同方法進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)或校準(zhǔn)；

⑸對(duì)存留物品進(jìn)行再檢測(cè)或再校準(zhǔn)。

8.標(biāo)線合格后，還要通過QC等觀察標(biāo)線的使用壽命！

常見問題：

五

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線需要人為的增加（0,0）點(diǎn)嗎？

不能。通常的標(biāo)準(zhǔn)系列多是配制0,1,2,3mg/L系列這樣的說法，沒做實(shí)驗(yàn)人為添加（0,0）很不妥，因?yàn)楹芏鄷r(shí)候0管進(jìn)入儀器可能也有響應(yīng)值，這也是我們考察試劑空白的一個(gè)重要步驟。這個(gè)0管在某些時(shí)候非常重要，比如全血鉛測(cè)定，我們采用牛血清來基體匹配標(biāo)準(zhǔn)系列，如果此時(shí)你用酸做空白或沒做實(shí)驗(yàn)人為添加（0,0），那你就很難做好標(biāo)準(zhǔn)曲線。所以標(biāo)準(zhǔn)曲線的0管也是做好標(biāo)準(zhǔn)曲線的重要考慮點(diǎn)。

2.標(biāo)準(zhǔn)曲線需要減掉試劑空白來做嗎？

不需要。儀器測(cè)出來標(biāo)準(zhǔn)系列的響應(yīng)值可以減掉試劑空白或減掉0管的響應(yīng)值來做，工作中我們也常用0管來做儀器調(diào)零。其實(shí)沒有必要那么麻煩，即使空白或0管有響應(yīng)值，在構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，我們已經(jīng)認(rèn)為該響應(yīng)值就是0濃度，也就是扣除了這個(gè)空白的。

3.什么時(shí)候用Y=bX和二次曲線呢？

標(biāo)準(zhǔn)曲線我們通常采用的是Y=a+bX，曲線擬合完必須要做統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，且要做統(tǒng)計(jì)完備的線性檢驗(yàn)和失擬檢驗(yàn)，然后再做a與0的差別檢驗(yàn)，如果a與0的統(tǒng)計(jì)學(xué)上無差異，你就可以考慮用Y=bX的擬合曲線，擬合出來后同樣做線性檢驗(yàn)和失擬檢驗(yàn)，如果線性檢驗(yàn)合格（P<0.05）且失擬檢驗(yàn)合格（p>0.05）此時(shí)你就可以采用Y=bX。二次曲線的采用同樣是這樣的道理，如果你Y=a+bX時(shí)擬合不合格，你就考慮用Y=a+bX+cX2，同樣做失擬檢驗(yàn)，考察擬合的符合情況。如果Y=a+bX 和Y=a+bX+cX2都滿足擬合檢驗(yàn)和失擬檢驗(yàn)合格，則采用Y=a+bX形式，這樣符合統(tǒng)計(jì)學(xué)上參數(shù)最少的統(tǒng)計(jì)簡(jiǎn)潔性原則。

4.標(biāo)準(zhǔn)曲線去查含量時(shí)是先減空白信號(hào)算樣品含量還是先算出空白含量相減呢？

工作中我們常要減掉空白得到樣品含量，現(xiàn)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法有的推薦先算出空白含量，用樣品含量相減，也有推薦先用樣品信號(hào)減空白信號(hào)然后去標(biāo)準(zhǔn)曲線推算含量。而且這兩種算法常常差距很大。其實(shí)這種差距往往是低含量水平時(shí)才出現(xiàn)，在低含量水平通過標(biāo)準(zhǔn)曲線推算含量時(shí)，本身不確定度就很大。這兩種方法都可以。個(gè)人推薦先用樣品信號(hào)減空白信號(hào)然后去標(biāo)準(zhǔn)曲線推算含量，因?yàn)檫@樣出來的含量不確定度要小一些，而先算出空白含量再相減就增加了1次標(biāo)準(zhǔn)曲線推算含量時(shí)的不確定度，因?yàn)楹玫臏y(cè)量永遠(yuǎn)是不確定度小的測(cè)量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法區(qū)別？

六

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法：

也稱外標(biāo)法或直接比較法，是一種簡(jiǎn)便、快速的定量方法。與分光光度分析中的標(biāo)準(zhǔn)曲線法相似，首先用欲測(cè)組分的標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體方法是：用標(biāo)準(zhǔn)樣品配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列，在與待測(cè)組分相同的色譜條件下，等體積準(zhǔn)確進(jìn)樣，測(cè)量各峰的峰面積或峰高，用峰面積或峰高對(duì)樣品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，此標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)是通過原點(diǎn)的直線。若標(biāo)準(zhǔn)曲線不通過原點(diǎn)，則說明存在系統(tǒng)誤差。標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率即為絕對(duì)校正因子。

在測(cè)定樣品中的組分含量時(shí)，要用與繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線完全相同的色譜條件作出色譜圖，測(cè)量色譜峰面積或峰高，然后根據(jù)峰面積和峰高在標(biāo)準(zhǔn)曲線上直接查出注入色譜柱中樣品組分的濃度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線法的優(yōu)點(diǎn)是：繪制好標(biāo)準(zhǔn)工作曲線后測(cè)定工作就變得相當(dāng)簡(jiǎn)單，可直接從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上讀出含量，因此特別適合于大量樣品的分析。

標(biāo)準(zhǔn)曲線法的缺點(diǎn)是：每次樣品分析的色譜條件（檢測(cè)器的響應(yīng)性能，柱溫，流動(dòng)相流速及組成，進(jìn)樣量，柱效等）很難完全相同，因此容易出現(xiàn)較大誤差。此外，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制時(shí)，一般使用欲測(cè)組分的標(biāo)準(zhǔn)樣品（或已知準(zhǔn)確含量的樣品），而實(shí)際樣品的組成卻千差萬別，因此必將給測(cè)量帶來一定的誤差。

2.標(biāo)準(zhǔn)加入法，又名標(biāo)準(zhǔn)增量法：

是一種被廣泛使用的檢驗(yàn)儀器準(zhǔn)確度的測(cè)試方法。這種方法尤其適用于檢驗(yàn)樣品中是否存在干擾物質(zhì)。

具體方法是：將一定量已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液加入待測(cè)樣品中，測(cè)定加入前后樣品的濃度。加入標(biāo)準(zhǔn)溶液后的濃度將比加入前的高，其增加的量應(yīng)等于加入的標(biāo)準(zhǔn)溶液中所含的待測(cè)物質(zhì)的量。如果樣品中存在干擾物質(zhì)，則濃度的增加值將小于或大于理論值。

總的來說，標(biāo)準(zhǔn)曲線法適用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的基體和樣品的基體大致相同的情況，優(yōu)點(diǎn)是速度快，缺點(diǎn)是當(dāng)樣品基體復(fù)雜時(shí)不正確。標(biāo)準(zhǔn)加入法可以有效克服上面所說的缺點(diǎn)，因?yàn)樗�是把樣品和�?biāo)準(zhǔn)混在一起同時(shí)測(cè)定的，但他也有缺點(diǎn)就是速度很慢。標(biāo)準(zhǔn)曲線法可在樣品很多的時(shí)候使用，先做出曲線，然后從曲線上找點(diǎn)，那樣方便。標(biāo)準(zhǔn)加入法，適合數(shù)量少的時(shí)候用。