蛋、家禽和肉類產(chǎn)品是沙門氏菌病的主要傳播媒介,感染主要取決于沙門氏菌的血清型和食用者的身體狀況,受威脅最大的是小孩、老年人及免疫缺陷個(gè)體.根據(jù)國(guó)際慣例,要求對(duì)易受沙門氏菌污染的食品進(jìn)行分類管理,以使大多數(shù)食物不含沙門氏菌,從而有效預(yù)防沙門氏菌病.為此,人們?cè)谔剿魃抽T氏菌檢測(cè)方法的過(guò)程中,作出了不懈的努力,現(xiàn)將有關(guān)進(jìn)展報(bào)告如下,并介紹兩種快速檢測(cè)沙門氏菌的試劑盒.

    自19世紀(jì)后期,沙門氏菌首次被鑒定為人類的一種病原以來(lái),檢測(cè)方法學(xué)都是建立在采取感染病人的糞便或血液作為臨床病料的基礎(chǔ)上.此后的60年間,用于從食品中分離沙門氏菌的方法實(shí)質(zhì)上與那些用于臨床病料的方法是相同的.但至少有三個(gè)因素限制了用于臨床病料的方法應(yīng)用在食品分析上.第一,通常,沙門氏菌的含量水平在污染食品中比有感染病人的病料中要低很多；第二,食品本身的性質(zhì)會(huì)干擾病原的檢測(cè),例如,某些食品中固有菌群可能處在一個(gè)很高的水平,從而影響特定細(xì)菌的選擇性分離和鑒定；第三,與臨床病料不同的是,經(jīng)過(guò)加工的食品,由于加熱、干燥、高含鹽量、酸和冷凍等因素的作用,其中的沙門氏菌受到了尚不致命的損傷或稱“致傷”.這就形成了一個(gè)具有不同生長(zhǎng)特性的細(xì)菌群.這種現(xiàn)象對(duì)那些希望從食物樣品中分離出沙門氏菌的食品分析家來(lái)說(shuō)有很大影響,因?yàn)樵谶x擇培養(yǎng)基上直接培養(yǎng)“致傷”的沙門氏菌通常是以細(xì)菌死亡和試驗(yàn)失敗而告終.為克服這些困難,人們建立了一種簡(jiǎn)單的微生物增殖步驟,專門針對(duì)以食品為傳播載體的病原.雖然這些方法本身證明是可靠的,但卻很費(fèi)力、耗時(shí),需要4～7天才能完成.因此,在需要及時(shí)、快速評(píng)價(jià)食品中微生物的安全性時(shí),通常不被采用.隨著DNA和抗體技術(shù)的發(fā)展,近10～15年間發(fā)展了無(wú)數(shù)改進(jìn)的方法,其中許多可以在48h內(nèi)檢出沙門氏菌,這些方法通稱為快速檢測(cè).

 

1、傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法

    用于沙門氏菌分析的傳統(tǒng)方法是食物樣品分步增菌,以增加病原的可檢出率,這種培養(yǎng)方法總體可分4個(gè)不同階段或步驟.第一步(預(yù)增菌),將樣品加到一種高營(yíng)養(yǎng)、無(wú)選擇性的培養(yǎng)基中,溫度37℃,使那些“致傷”的細(xì)菌復(fù)蘇及使所有微生物生長(zhǎng).雖然緩沖胨水被建議常規(guī)使用(由于其可保持溶液pH值穩(wěn)定),但對(duì)培養(yǎng)基的選擇仍存有爭(zhēng)論.第二,是選擇性增菌步驟,它使沙門氏菌生長(zhǎng)而使肉湯中同時(shí)存在的微生物數(shù)量減少,與預(yù)增菌培養(yǎng)基相似,對(duì)選擇性培養(yǎng)基的選擇,也存在許多不同的觀點(diǎn).目前應(yīng)用的主要有如下3種類型：連四硫基鹽肉湯(Tetrathionate broth)、硒酸鹽胱氨酸肉湯(Selenite cystine broth)和RV(Rappaport-Vassiliadis)培養(yǎng)基.由于沒(méi)有任何一種培養(yǎng)基可以全面地保持所有食品基質(zhì)或各種沙門氏菌血清型,所以,較適當(dāng)?shù)淖龇ň褪鞘褂脙煞N培養(yǎng)基平行地進(jìn)行試驗(yàn).第三步是分離步驟,即選擇性培養(yǎng)物在含一種或多種抑制非沙門氏菌生長(zhǎng)制劑的瓊脂平板上劃線培養(yǎng),然后對(duì)平板上肉眼可見(jiàn)的特征性菌落進(jìn)行確認(rèn),并對(duì)該菌落分離物進(jìn)行一系列生化和血清學(xué)檢測(cè),以作出鑒定.傳統(tǒng)沙門氏菌檢測(cè)法全過(guò)程需時(shí)至少4～7天,才能得出明確的診斷結(jié)果.

2、以抗體為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法

    利用抗原-抗體反應(yīng)的顯著特異性,來(lái)進(jìn)行細(xì)菌的鑒別和血清學(xué)定型,已有半個(gè)多世紀(jì)的歷史.細(xì)菌菌體或鞭毛抗原的特異性抗體的存在,使得人們可以建立一些快速方法來(lái)檢測(cè)以食品為載體的病原.已經(jīng)建立的沙門氏菌免疫學(xué)檢測(cè)方法有許多種,大致可分為以酶標(biāo)抗體(ELISA),熒光抗體染色(免疫熒光法),同位素標(biāo)記抗體(放射免疫試驗(yàn))為基礎(chǔ)的方法及其它多種以抗體為基礎(chǔ),利用乳膠凝集、免疫傳感器、免疫擴(kuò)散及免疫色譜技術(shù)的方法.但常規(guī)中最廣泛采用的是以雙位點(diǎn)ELISA技術(shù)即夾心ELISA為基礎(chǔ)的方法.此法改進(jìn)后用有放射活性的同位素替代標(biāo)記抗體,概括地說(shuō),是指以固定在固體基質(zhì)上的“捕捉”抗體來(lái)捕捉目標(biāo)抗原,經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的成分,加入第二種酶標(biāo)抗體,此者結(jié)合在捕捉到的抗原的不同位點(diǎn)上,第二次洗滌后加入酶作用基質(zhì),并令其與顏色成分反應(yīng),然后用分光光度法即很容易檢測(cè)到目標(biāo)抗原.采用微量滴定板作為固態(tài)基質(zhì)使反應(yīng)形式標(biāo)準(zhǔn)化,并促成其自動(dòng)化.

    最近黎兆滾等人首次在國(guó)內(nèi)口岸系統(tǒng)應(yīng)用微量板ELISA法(Salmonelle test 1)對(duì)進(jìn)出口動(dòng)物產(chǎn)品(魚(yú)粉、肉骨粉等)進(jìn)行沙門氏菌檢測(cè).該法采用預(yù)先包被了沙門氏菌(A-E群)單克隆抗體的微量板,加入經(jīng)增菌處理的樣品,反應(yīng)后再加入一定的指示劑,作用畢后用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值來(lái)判定結(jié)果.食物樣品經(jīng)適當(dāng)?shù)脑鼍�處�?也可用此法進(jìn)行沙門氏菌檢測(cè).

    ELISA法檢出沙門氏菌的極限范圍在105～106個(gè)細(xì)胞/ml,因此,要得出可靠的結(jié)果,食物樣品首先必需進(jìn)行預(yù)增菌、選擇性增菌,通常還要在含有D-甘露糖的肉湯(M肉湯)中進(jìn)行后增菌,以促進(jìn)鞭毛發(fā)育.總的來(lái)說(shuō),標(biāo)準(zhǔn)的ELISA法樣品的制備,約需要經(jīng)過(guò)40～48h的孵育才能完成.黎兆滾等人的微量板ELISA法(Salmonella test 1)樣品制備過(guò)程分三步,共耗時(shí)24h：①選用營(yíng)養(yǎng)肉湯進(jìn)行預(yù)增菌(6h),使“致傷”、冷凍的沙門氏菌復(fù)蘇.②使用選擇性培養(yǎng)基RV進(jìn)行增菌(14h),使沙門氏菌大量繁殖,同時(shí)抑制其它雜菌生長(zhǎng).③使用營(yíng)養(yǎng)肉湯(蛋白胨水)進(jìn)行后增菌(4h),使沙門氏菌的數(shù)量大大增加.比上述標(biāo)準(zhǔn)的ELISA法樣品制備過(guò)程縮短了一半的時(shí)間.ELISA方法本身,則僅需要大約2h而已(其中30min是操作時(shí)間,90min是孵育時(shí)間).相比之下,黎兆滾等人的方法可在27h內(nèi)完成,比上述方法縮短了一半的時(shí)間,頗值得推廣應(yīng)用.

    最新式的沙門氏菌免疫學(xué)檢測(cè)法,利用經(jīng)特異性抗體敏化的免疫色譜卡片為基礎(chǔ).幾滴樣品加到卡片上,結(jié)果可以直接用肉眼讀出.免疫色譜卡片極易操作,且由于無(wú)需要特殊設(shè)備,很適合小型實(shí)驗(yàn)室使用.盡管卡片檢測(cè)法與ELISA法一樣需要對(duì)樣品進(jìn)行增菌處理,但它(卡片法)本身通常需時(shí)不超過(guò)10min,如果采用黎兆滾等人的樣品制備法,則可使操作時(shí)間更為縮短.

 

3、以核酸為基礎(chǔ)的方法

    細(xì)胞核酸DNA和RNA是唯一一類可以攜帶信息的大分子.由于所有的細(xì)胞都含有這種分子,可以利用它作為檢測(cè)的標(biāo)靶.標(biāo)靶通常是一個(gè)特異性核酸序列,它可通過(guò)以補(bǔ)體核酸分子作為探針來(lái)檢出.與免疫學(xué)方法相似,探針也需要加附適當(dāng)?shù)臉?biāo)記,如放射性同位素、酶或發(fā)光的標(biāo)識(shí)物.Fitts等人在食品沙門氏菌檢測(cè)中引入了第一代DAN—RNA雜交技術(shù),此法應(yīng)用的探針含有用放射性同位素標(biāo)記的傷寒沙門氏菌DNA片段,其敏感性高,經(jīng)大約48h的增菌步驟后,檢測(cè)極限可達(dá)108個(gè)細(xì)菌/ml,但由于要使用放射性同位素,只能在專門的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用,此方法的優(yōu)點(diǎn)都被抵消了.為此,以核酸雜交為基礎(chǔ)的第二代技術(shù)—比色計(jì)目前已發(fā)展起來(lái).這種方法依賴于沙門氏菌核糖體RNA(rRNA)—核糖體發(fā)育過(guò)程中儲(chǔ)存的核酸成分的檢測(cè).核糖體是細(xì)胞蛋白質(zhì)合成器的一部分,每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中存在5000～20 000個(gè)復(fù)制體,而相比之下染色體DNA復(fù)制體僅2～10個(gè).這種天然富含rRNA標(biāo)靶序列的情況使得用無(wú)輻射計(jì)檢測(cè)成為可能,同時(shí)又保持了與放射性同位素方法相當(dāng)或更高的敏感性.其另一優(yōu)點(diǎn)是由于rRNA為單鏈(而DNA為雙鏈),雜交前無(wú)需經(jīng)過(guò)變性步驟.要得到陽(yáng)性結(jié)果,此法需要105個(gè)靶細(xì)胞/ml,因此對(duì)沙門氏菌檢測(cè)來(lái)說(shuō),需要進(jìn)行預(yù)增菌和選擇性增菌,總共約50h.rRNA探針?lè)ū壬抽T氏菌ELISA法更耗時(shí),但二者成本相近.

 食品細(xì)菌檢測(cè)法的最新進(jìn)展是在化學(xué)擴(kuò)增體系方面的發(fā)展,即聚合酶鏈反應(yīng)(PCR),用該體系可對(duì)制備好的樣品進(jìn)行細(xì)菌DNA擴(kuò)增,以便更易于用諸如凝膠電泳法或比色型ELISA法檢測(cè).用于檢測(cè)沙門氏菌和其它以食物為載體的病原的PCR方法業(yè)已建立,其中一些方法顯示了極好的敏感性.但該法較難自動(dòng)化,且必需經(jīng)選擇性增菌以稀釋可能干擾檢測(cè)反應(yīng)的某些成分.一個(gè)完整的以PCR為基礎(chǔ)的方法,需要2天才能完成,很大程度上抵銷了其高敏感性的優(yōu)點(diǎn),但這種方法對(duì)那些含沙門氏菌較少或沙門氏菌“致傷”嚴(yán)重難以復(fù)蘇而仍保有沙門氏菌rRNA的樣品尤其有效.

    盡管目前用來(lái)檢測(cè)沙門氏菌的方法各有優(yōu)缺點(diǎn),但隨著科學(xué)發(fā)展,技術(shù)進(jìn)步,人們探索、實(shí)踐的繼續(xù)深入,我們可以期待,將會(huì)有更多,敏感性更高,特異性更強(qiáng),診斷時(shí)間更短的新方法出現(xiàn).

 

4、兩種沙門氏菌快速檢測(cè)法

4.1　Transia沙門氏菌平板檢測(cè)法

    與耗時(shí)、昂貴的傳統(tǒng)方法相比,此法快1～2天,且每次檢測(cè)所需的操作時(shí)間縮短.該法建立在夾心ELISA法的基礎(chǔ)上,利用多抗體混合物以保證檢出所有的沙門氏菌血清型.反應(yīng)的固相載體是一種有可見(jiàn)或不可見(jiàn)條紋的微量反應(yīng)板.其小孔內(nèi)包被有沙門氏菌的特異性單克隆抗體.

    第一階段,在小孔內(nèi)加入樣品和抗體聯(lián)合物(沙門氏菌屬特異性單克隆和多克隆抗體的混合物).孵育期間,沙門氏菌抗原和包被抗體形成了一種復(fù)合物：包被單克隆抗體-沙門氏菌抗原-抗體聯(lián)合物.洗滌后,通過(guò)每孔加入基質(zhì)溶液(過(guò)氧化脲)和色素原溶液(四甲基氨基丙苯)來(lái)顯示上述復(fù)合物;酶催化色素原的氧化,結(jié)果產(chǎn)生藍(lán)色.加入反應(yīng)終止液終止催化反應(yīng),并使反應(yīng)混合物酸化,顏色由藍(lán)變黃.

    這種ELISA方法可對(duì)經(jīng)選擇性增菌及熱休克作用后,釋放了特異性沙門氏菌抗原的食品和環(huán)境樣品進(jìn)行檢測(cè).如采用黎兆滾等人的樣品制備法,可大大縮短檢測(cè)時(shí)間；此法可在沒(méi)有酶標(biāo)儀的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,從這點(diǎn)來(lái)說(shuō),Transia沙門氏菌平板檢測(cè)法比黎兆滾等人的微量板ELISA法(Salmonella test 1)更適應(yīng)于一般的實(shí)驗(yàn)室使用.

4.2　Transia沙門氏菌卡片檢測(cè)法

    此法以單步免疫反應(yīng)即夾心型免疫色譜反應(yīng)為基礎(chǔ).反應(yīng)固相包括一塊用“抗沙門氏菌抗體-染料”偶合物浸透的染料襯墊和一張薄膜條,抗沙門氏菌抗體就固定在薄膜的反應(yīng)區(qū)上.增菌后,增菌肉湯用移液管加到樣品小孔內(nèi)并令其吸收,如樣品存在沙門氏菌抗原,它們會(huì)與偶合物作用,然后依次遷移到膜上,與固定在膜上反應(yīng)區(qū)的抗體結(jié)合,在反應(yīng)窗上呈現(xiàn)一條色帶.最后結(jié)果可在5～7min內(nèi)讀取.此法也適用于沒(méi)有酶標(biāo)儀的實(shí)驗(yàn)室.如采用黎兆滾等人的樣品制備法,可更加縮短檢測(cè)時(shí)間,可在普通實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行.