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傳代細(xì)胞株體外培養(yǎng)、鑒定與形態(tài)觀察

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2013-08-30  來源:實(shí)驗(yàn)室資訊網(wǎng)
核心提示:1. 標(biāo)本采集 在無菌條件下于健康產(chǎn)婦分娩后立即取新生兒臍帶, 擠出臍帶血管中的血液,放入裝有含青鏈霉素的PBS液瓶中,2h之內(nèi)
 1. 標(biāo)本采集 在無菌條件下于健康產(chǎn)婦分娩后立即取新生兒臍帶, 擠出臍帶血管中的血液,放入裝有含青鏈霉素的PBS液瓶中,2h之內(nèi)行臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)。
雙抗:青霉素100u/ml; 鏈霉素100μl/ml
PBS:KCl 0.2 g/L, KH2PO4 0.24 g/L, NaCl 8.0g/L, Na2HPO4•7H2O 1.56g/L或Na2HPO4 1.44 g/L。 在800ml蒸餾水中加入上述質(zhì)量物質(zhì),用鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4,加水定容至1L,高壓蒸汽滅菌20分鐘,室溫保存。
 
2. 原代血管內(nèi)皮細(xì)胞的獲取與培養(yǎng) 按Jaffe等人〔1〕的方法加以改進(jìn)。在無菌條件下取新生兒臍帶,剪去鉗痕和凝血塊阻塞部分,找到臍靜脈。一端插上帶有膠管的玻璃管結(jié)扎固定,經(jīng)膠管接注射器,用生理鹽水灌洗。待臍靜脈內(nèi)的殘血除凈后,用37℃ PBS,沖洗兩次,將另一端用鐵夾夾閉,向臍靜脈內(nèi)灌注0.25%胰蛋白酶8~10ml,夾閉膠管放入已滅菌的大平皿中。37℃孵育12min,在此期間經(jīng)常翻動(dòng)臍帶使酶溶液在血管內(nèi)流動(dòng)以促使內(nèi)皮細(xì)胞均勻與酶接觸。取出臍帶后輕輕擠壓管壁,將含有內(nèi)皮細(xì)胞的胰蛋白酶注入50ml錐形離心管中,加入小牛血清2ml終止酶反應(yīng)。再以30ml PBS沖洗管腔,流出液一并入離心管,1000r/min離心10min,棄上清,加入含有10%小牛血清的DMEM [或IMDM(Dibco)?]培養(yǎng)液,充分混合制成細(xì)胞懸液。取0.1ml細(xì)胞懸液在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。最后調(diào)細(xì)胞數(shù),以1×105/ml接種至24孔培養(yǎng)板中,每孔1ml。置于5%CO2,37℃靜止培養(yǎng)24h更換培養(yǎng)液,以除去未貼壁的細(xì)胞。以后每隔2d換液1次,以維持細(xì)胞的營養(yǎng)和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。
胰蛋白酶溶液(100ml)配制:1)將D-Hanks(橙紅色)液高壓消毒滅菌,用NaHCO3液調(diào)節(jié)pH至7.2左右。 2)稱取胰蛋白酶粉末置燒杯中,先用少許消毒的鹽溶液調(diào)成糊狀,然后再補(bǔ)足鹽溶液,攪拌混勻,置室溫4小時(shí)或冰箱內(nèi) ,并不時(shí)攪拌振蕩。 3)次日先用濾紙粗慮,再過濾除菌,分裝入瓶中,低溫冰箱或-20℃保存?zhèn)溆,常用濃度?.25%或0.125%;胰蛋白酶溶液(深紅色)偏酸,使用前用NaHCO3調(diào)pH至7.2左右。
D-Hanks液配制:
KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06 g/L , NaCl 8.0g/L, NaHCO3 0.35 g/L,
Na2HPO4•7H2O 0.06g/L, 酚紅 0.02 g/L
 
3. 傳代內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng) 原代內(nèi)皮細(xì)胞融合后用培養(yǎng)液沖洗兩次,然后用0.25%胰酶加入到內(nèi)皮細(xì)胞中,每孔0.3ml。邊消化邊在倒置顯微鏡下觀察。細(xì)胞皺縮、彼此分離或呈大片狀分離即可終止消化。加入含有10%小牛血清的培養(yǎng)液,吸管吹打,制成細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)后按105個(gè)細(xì)胞/ml,繼續(xù)培養(yǎng)。
 
4.血管內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定  1)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)。2)VWF相關(guān)抗原免疫熒光檢查:在24孔塑料培養(yǎng)板孔內(nèi)放置無菌的蓋玻片0.5cm×0.6cm,每孔中種植1ml含有105個(gè)細(xì)胞的原代或傳代內(nèi)皮細(xì)胞懸液。待內(nèi)皮細(xì)胞生長至近融合狀態(tài)時(shí),取出蓋玻片,用PBS沖洗3次,投入冷丙酮中(-18~-20℃),細(xì)胞面向上,作用7min,用PBS沖洗3次,每次1min,而后進(jìn)行間接免疫熒光檢查,第一抗體為鼠抗人VWF單克隆抗體,1∶20倍稀釋,加入50μl于蓋玻片上,放入濕盒內(nèi)4℃ 。同時(shí)不加一抗做陰性對(duì)照。用PBS沖洗3次后,加入異硫氫酸標(biāo)記的二抗50μl,放入37℃2h后,用PBS洗滌3次。然后立即在熒光顯微鏡下觀察,攝片。 血管內(nèi)皮細(xì)胞鑒定結(jié)果: VWF相關(guān)抗原間接免疫熒光檢查,原代及傳代培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞漿中有黃綠色的熒光著色,胞核呈黑綠色,整個(gè)細(xì)胞輪廓清楚。作為對(duì)照的內(nèi)皮細(xì)胞片子中,偶見綠色斑點(diǎn)散發(fā)熒光,未見細(xì)胞輪廓。
 
5. 內(nèi)皮細(xì)胞體外生長情況  用胰蛋白酶消化的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,接種在24孔塑料培養(yǎng)板各孔內(nèi)4h后,大部分細(xì)胞貼壁。早期細(xì)胞呈小多角、球形、呈團(tuán)狀,少數(shù)細(xì)胞伸展,48~72h生長最快,逐漸生長成梭形,有些細(xì)胞排列呈魚貫狀相連,間有旋禍狀排列。核清晰,呈圓形或橢圓形,核分裂相多見,1~2核仁,胞漿豐富,內(nèi)含小顆粒。于3~4d后融合,7~10d胞體呈多角形,相互嵌合,為單層呈鋪路石狀排列。
編輯:songjiajie2010

 
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