[實(shí)驗(yàn)?zāi)康腯

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)DNA的限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)的基本原理與實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

[實(shí)驗(yàn)原理]

1.限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識(shí)別序列的DNA 序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上,并切割雙鏈DNA。它可分為三類:Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴于ATP 的存在。Ⅰ類酶結(jié)合于識(shí)別位點(diǎn)并隨機(jī)的切割識(shí)別位點(diǎn)不遠(yuǎn)處的DNA，而Ⅲ類酶在識(shí)別位點(diǎn)上切割DNA 分子,然后從底物上解離。Ⅱ類由兩種酶組成: 一種為限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶),它切割某一特異的核苷酸序列; 另一種為獨(dú)立的甲基化酶,它修飾同一識(shí)別序列。絕大多數(shù)Ⅱ類限制酶識(shí)別長(zhǎng)度為4 至6個(gè)核苷酸的回文對(duì)稱特異核苷酸序列(如EcoRⅠ識(shí)別六個(gè)核苷酸序列:5"- G↓AATTC-3"),有少數(shù)酶識(shí)別更長(zhǎng)的序列或簡(jiǎn)并序列。Ⅱ類酶切割位點(diǎn)在識(shí)別序列中,有的在對(duì)稱軸處切割,產(chǎn)生平末端的DNA 片段(如Sma:5"-CCC↓GGG-3");有的切割位點(diǎn)在對(duì)稱軸一側(cè),產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA 片段稱粘性未端, 如EcoRⅠ切割識(shí)別序列后產(chǎn)生兩個(gè)互補(bǔ)的粘性末端。 5"…G↓AATTC…3" →5"…G AATTC…3" ；3"…CTTAA↑G …5" →3"…CTTAA G…5"

2.DNA 純度、緩沖液、溫度條件及限制性內(nèi)切酶本身都會(huì)影響限制性內(nèi)切酶的活性。大部分限制性內(nèi)切酶不受RNA 或單鏈DNA 的影響。當(dāng)微量的污染物進(jìn)入限制性內(nèi)切酶貯存液中時(shí),會(huì)影響其進(jìn)一步使用,因此在吸取限制性內(nèi)切酶時(shí),每次都要用新的吸管頭。如果采用兩種限制性內(nèi)切酶,必須要注意分別提供各自的最適鹽濃度。若兩者可用同一緩沖液,則可同時(shí)水解。若需要不同的鹽濃度,則低鹽濃度的限制性內(nèi)切酶必須首先使用,隨后調(diào)節(jié)鹽濃度,再用高鹽濃度的限制性內(nèi)切酶水解。也可在第一個(gè)酶切反應(yīng)完成后，用等體積酚/氯仿抽提，加0.1倍體積3mol/LNaAc 和2倍體積無(wú)水乙醇，混勻后置于-70℃低溫冰箱內(nèi)30 分鐘，離心、干燥并重新溶于緩沖液后進(jìn)行第二個(gè)酶切反應(yīng)。

3.DNA 限制性內(nèi)切酶酶切圖譜又稱DNA 的物理圖譜，它由一系列位置確定的多種限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)組成，以直線或環(huán)狀圖式表示。構(gòu)建DNA 限制性內(nèi)切酶圖譜有許多方法。通常結(jié)合使用多種限制性內(nèi)切酶，通過(guò)綜合分析多種酶單切及不同組合的多種酶同時(shí)切所得到的限制性片段大小來(lái)確定各種酶的酶切位點(diǎn)及其相對(duì)位置。酶切圖譜的使用價(jià)值依賴于它的準(zhǔn)確性和精確程度。在酶切圖譜制作過(guò)程中，為了獲得條帶清晰的電泳圖譜，一般DNA 用量約為0.5-1μg。限制性內(nèi)切酶的酶解反應(yīng)最適條件各不相同,各種酶有其相應(yīng)的酶切緩沖液和最適反應(yīng)溫度(大多數(shù)為37℃)。對(duì)質(zhì)粒DNA 酶切反應(yīng)而言, 限制性內(nèi)切酶用量可按標(biāo)準(zhǔn)體系1μg DNA 加1 單位酶,消化1-2 小時(shí)。但要完全酶解則必須增加酶的用量,一般增加2-3 倍,甚至更多,反應(yīng)時(shí)間也要適當(dāng)延長(zhǎng)。

[實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備]

水平式電泳裝置,電泳儀,臺(tái)式高速離心機(jī), 恒溫水浴鍋, 微量移液槍, 微波爐,紫外透射儀,照相系統(tǒng)

[實(shí)驗(yàn)材料]

λDNA; 重組pBS 質(zhì)料或pUC19 質(zhì)粒; EcoRI 酶及其酶切緩沖液; HindⅢ酶及其酶切緩沖液;瓊脂糖(Agarose)。

附試劑的配制：

1、 5×TBE 電泳緩沖液：見(jiàn)實(shí)驗(yàn)二。

2、 6×電泳載樣緩沖液：見(jiàn)實(shí)驗(yàn)二。

3、 溴化乙錠：見(jiàn)實(shí)驗(yàn)二。

[實(shí)驗(yàn)步驟]

1.將清潔干燥并經(jīng)滅菌的eppendorf 管(最好0.5ml)編號(hào),用微量移液槍分別加入DNA1μg 和相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)10×緩沖液2μl,再加入重蒸水使總體積為19μl,將管內(nèi)溶液混勻后加入1μl 酶液,用手指輕彈管壁使溶液混勻,也可用微量離心機(jī)甩一 下,使溶液集中在管底。

2. 混勻反應(yīng)體系后,將eppendorf 管置于適當(dāng)?shù)闹С治锷希ㄈ绮逶谂菽�塑料板上�?37℃水浴保溫2-3 小時(shí),使酶切反應(yīng)完全。

3.每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混勻,以停止反應(yīng),置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?/div> 1天內(nèi)可完成，上午做內(nèi)切酶酶切反應(yīng)，下午做電泳檢測(cè)。