1.消化：樣品與硫酸一起加熱消化，硫酸使有機物脫水。并破壞有機物，使有機物中的C、H氧化為CO2和H2O蒸汽逸出，而pro則分解氮，與硫酸結(jié)合成硫酸銨，留在酸性溶液中。

在消化過程中添加硫酸鉀可以提高溫度加快有機物分解，它與硫酸反應(yīng)生成硫酸氫鉀，可提高反應(yīng)溫度，一般純硫酸加熱沸點330℃，而添加硫酸鉀后，溫度可達(dá)400℃，加速了整個反應(yīng)過程。此外，也可以加入硫酸鈉，氫化鉀鹽類來提高沸點。其理由隨著消化過程硫酸的不斷地被分解，水分的逸出而使硫酸鉀的濃度增大，沸點增加。加速了有機的分解。但硫酸鉀加入量不能太大，否則溫度太高，生成的硫酸氫銨也會分解，放出氨而造成損失。

為了加速反應(yīng)過程，還加入硫酸銅，氧化汞或硒粉作為催化劑以及加入少量過氧化氫，次氯酸鉀作為氧化劑。但為了防止污染通常使用硫酸銅。

所以有機物全部消化后，出現(xiàn)硫酸銅的蘭綠色，它具有催化功能，還可以作為堿性反應(yīng)指示劑。

2.蒸餾：樣液中的硫酸銨在堿性條件下釋放出氨，在這操作中，一是加入氫氧化鈉溶液要過量，二是要防止樣液中氨氣逸出。

3.吸收與滴定：蒸餾過程中放出的氨可用一定量的標(biāo)準(zhǔn)硫酸或標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液進行氨的吸收，然后再用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液反滴定過剩的硫酸或鹽酸溶液，從而計算出總氮量（AOAC方法）。

半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸直接滴定，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影響指示劑變色反應(yīng)，它有吸收氨的作用。

蛋白質(zhì)檢測注意事項

1.樣品應(yīng)是均勻的，若是固體樣品應(yīng)事先研細(xì)過篩，液體樣要混合均勻。

2.樣品放入凱氏燒瓶時，不要黏附瓶頸上，萬一黏附可用少量水緩慢沖下，以免被檢樣消化不完全，使結(jié)果偏低。

3.使用自動凱氏定氮儀在檢測樣品前需做空白試驗對照。

4.有機物分解需要H2SO4量，H2SO4應(yīng)根據(jù)有機物種類不同而加的量就不同，如果試樣含脂類高，則加H2SO4多，為了提高分解溫度，要大量添加K2SO4，但不能太多，也不能太少，太少則氨化不充分。K2SO4和H2SO4的添加比例是：

1g樣品  K2SO4：H2SO4=7g：12ml，這種比例在國內(nèi)外都使用，是公認(rèn)的，還有一種比例：K2SO4：H2SO4=10 g：20ml。

5.對于蛋白質(zhì)含量較高或者含量特別低的樣品需要適當(dāng)減少或增加稱樣量，以免造成誤差。

6.在整個消化過程中，不要用強火，保持和緩的沸騰，使火力集中在凱氏燒瓶底部，以免附在壁上的蛋白質(zhì)在無硫酸存在的情況下，使氮有損失。對于水分或者脂肪含量較高的樣品，消化溫度宜逐漸增加。如果直接增加至420℃容易造成樣品飛濺至消化管壁從而導(dǎo)致消化不完全，使實際檢測結(jié)果偏低。

7.如硫酸缺少，過多的硫酸鉀會引起氨的損失，這時會形成硫酸氫鉀，而不與氨作用，因此當(dāng)硫酸過多底物被消耗掉或樣品中脂肪含量過高時，要添加硫酸量。

8.消化劑綠色后繼續(xù)消化30分鐘即可。

9.混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色，如果沒有溴甲酚綠，可單獨使用0.1%甲醛紅乙醇溶液。

10.自動凱氏定氮儀屬貴重儀器，操作完成后及時做好清洗工作并定期保養(yǎng)。

11.向蒸餾瓶中加入濃堿時，往往出現(xiàn)褐色沉淀。這時由于分解促進劑與加入的硫酸銅反應(yīng)，生成氫氧化銅，經(jīng)加熱后又分解生成氧化銅的沉淀，有時Cu離子與氨作用生成深蘭色的絡(luò)合物。

12.濃硫酸屬強酸且腐蝕性較強，在操作過程中需注意安全，充分做好自我保護措施。如防毒面具、手套、護目鏡等。

13.目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替H2SO4，這樣可省略了反滴定，H2SO4是強酸，要求較嚴(yán)，而硼酸是弱酸，在滴定時，不影響指示劑變色范圍，另外硼酸為吸收液濃度在2%即可將氨完全吸收。

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