一
核酸檢測
所有生物除朊病毒外都含有核酸，核酸包括脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。新型冠狀病毒(2019-nCoV)屬于Beta冠狀病毒屬(Betacoronavirus)，該病毒是蛋白包裹的單鏈正鏈RNA病毒，寄生和感染高等動(dòng)物（包括人）。病毒中特異性RNA序列是區(qū)分該病毒與其它病原體的標(biāo)志物，新型冠狀病毒出現(xiàn)后，我國科學(xué)家已經(jīng)成功發(fā)現(xiàn)了新型冠狀病毒中的特異性核酸序列。如疑似患者樣本中能檢測到新型冠狀病毒的特異性核酸序列，則認(rèn)為該患者可能被新型冠狀病毒感染。新型冠狀病毒常用的核酸診斷方法有兩種：病毒核酸特異基因檢測和病毒基因組測序。最常見的檢測新型冠狀病毒特異性核酸序列的方法是熒光定量PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）。由于新型冠狀病毒是RNA病毒，試劑盒檢測基本都采用反轉(zhuǎn)錄加實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（RT-PCR），擴(kuò)增病原體的核酸 (RNA) ，同時(shí)通過熒光探針實(shí)時(shí)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。在PCR反應(yīng)體系中，包含一對(duì)特異性引物以及一個(gè)Taqman探針，該探針為一段特異性寡核苷酸序列，兩端分別標(biāo)記了報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；如反應(yīng)體系存在靶序列，PCR反應(yīng)時(shí)探針與模板結(jié)合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性將探針酶切降解，報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，發(fā)出熒光。每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子產(chǎn)生。熒光定量PCR儀能夠監(jiān)測出熒光到達(dá)預(yù)先設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)（Ct值）與病毒核酸濃度有關(guān)，病毒核酸濃度越高，Ct值越小。不同生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品會(huì)依據(jù)自身產(chǎn)品的性能確定本產(chǎn)品的陽性判斷值。
由于每個(gè)RT-PCR反應(yīng)需要2個(gè)小時(shí)左右才出結(jié)果，因此，試劑盒在開發(fā)時(shí)一般都針對(duì)病毒序列中高度保守的2-3個(gè)序列比如編碼replicase（復(fù)制酶）或者necleocapsid（核蛋白衣，核鞘）的核酸序列設(shè)計(jì)引物，但是各個(gè)方法用的序列都不完全相同。一些方法使用multiplex，也就是把多個(gè)目標(biāo)序列在同一反應(yīng)管中擴(kuò)增；另一些采用分步，先用一個(gè)目標(biāo)序列篩查，陽性后再用另一個(gè)序列確認(rèn)，這樣可以有效縮短整個(gè)流程時(shí)間，加快檢測速度。另外RNA病毒變異很快，用多個(gè)保守目標(biāo)序列可以防止病毒變異造成的假陰性。
目前批準(zhǔn)產(chǎn)品均基于新型冠狀病毒基因組中開放讀碼框1a/b（open reading frame 1ab，ORF1ab）、包膜蛋白（Envelope protein，E）和核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，N）進(jìn)行選擇。不同產(chǎn)品的檢測原理基本一致，但是其引物、探針設(shè)計(jì)存在不同，有單靶區(qū)段（ORF1ab）、雙靶區(qū)段（ORF1ab、N蛋白）、三靶區(qū)段（ORF1ab、N蛋白和E蛋白）的檢測和判讀差別。一般檢測位于病毒ORF1ab和N基因上的兩個(gè)靶標(biāo)，同一份標(biāo)本需滿足雙靶標(biāo)陽性或重復(fù)檢測為單靶標(biāo)陽性或兩種標(biāo)本同時(shí)滿足單靶標(biāo)才能確認(rèn)SARS-CoV-2病毒核酸陽性。
檢測程序需要經(jīng)過五個(gè)步驟，取樣、留樣、保存、核酸提取、上機(jī)檢測。首先根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行樣本采集，樣本類型包括咽拭子、鼻拭子、痰液、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液等。由于RNA易降解，因此，采集樣本時(shí)使用無RNA酶的拭子和無RNA酶的儲(chǔ)存管。獲得患者樣本后，需盡快進(jìn)行檢測，如無法立即檢測需要進(jìn)行低溫封裝，并送到專門的檢測機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢測。檢測機(jī)構(gòu)收到樣本后，對(duì)樣本進(jìn)行核酸提取，核酸提取試劑應(yīng)使用批準(zhǔn)產(chǎn)品說明書中指定的核酸提取試劑盒。最后是熒光PCR核酸檢測，也就是上機(jī)器檢測，將提取物進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)，需要70—80分鐘。
二
抗體檢測
病毒侵入人體后，人體會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體進(jìn)行防御。免疫球蛋白是機(jī)體在抗原物質(zhì)刺激下由漿細(xì)胞產(chǎn)生的一類能與抗原特異性結(jié)合的血清活性成分，根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和抗原特異性的不同，將免疫球蛋白分為五類：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。
抗原初次進(jìn)入機(jī)體后，經(jīng)過一定的潛伏期產(chǎn)生漿細(xì)胞并合成分泌抗體。最早出現(xiàn)的是IgM，但該抗體維持時(shí)間短、濃度低、親和力較低，在血中持續(xù)數(shù)日至數(shù)周，是急性期感染的診斷指標(biāo)；在IgM接近消失時(shí)，IgG的含量達(dá)到高峰，IgG產(chǎn)生晚，但濃度高、維持時(shí)間長、親和力高，血清IgG陽性提示感染中后期或既往感染，當(dāng)數(shù)月乃至數(shù)年再次接觸相同抗原時(shí)，最初原抗體量稍有下降，可能是由于一部分原有抗體被再次進(jìn)入的抗原所結(jié)合，從而暫時(shí)降低了抗體含量，但短期內(nèi)抗體含量迅速增加，可能比原來抗體含量高數(shù)倍至數(shù)十倍，以IgG為主，在體內(nèi)持續(xù)時(shí)間也長，IgM很少增加。本次疫情中，通過研究者對(duì)COVID-19患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，病毒侵入人體后，IgM抗體大約需要5-7天產(chǎn)生，IgG抗體在10-15天時(shí)產(chǎn)生。2020年3月4日，國家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布了最新版本的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》在原有診療方案的基礎(chǔ)上增加了血清學(xué)檢測，作為確診病例和疑似病例的診斷依據(jù)之一。血清學(xué)檢測便是通過檢測血液樣本中的特異性抗體IgM和IgG的存在及含量，來間接判斷體內(nèi)有無病毒及病毒感染情況。目前臨床中常用的抗體血清學(xué)檢測方法有3種：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法、膠體金免疫層析法。
ELISA是一種結(jié)合抗原、抗體特異性反應(yīng)和酶對(duì)底物高效催化作用的高敏感性免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。測定時(shí)，受檢的標(biāo)本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)結(jié)合在固相載體上。固相上的酶量與標(biāo)本中的受檢物質(zhì)的量成比例。加入酶反應(yīng)底物后，底物被催化成有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)。所以，可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行半定量或定性分析。該檢測方法靈敏度較高，載體標(biāo)準(zhǔn)化難度較低，但檢測速度慢、易污染、步驟較為繁瑣。在實(shí)際應(yīng)用中，需要根據(jù)抗原抗體的特性設(shè)計(jì)不同的檢測法，目前有雙抗體夾心法、免疫抑制法、競爭法、直接法&間接法等類型。
是以膠體金為示蹤標(biāo)志物，應(yīng)用于抗原抗體檢測的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)，氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金試紙，是將膠體金標(biāo)記的生物大分子在PVC材質(zhì)的試紙固定，留加樣孔，并設(shè)檢測線和質(zhì)量控制線。在加樣孔上加入樣品后，再滴加液體介質(zhì)，試紙上進(jìn)行層析。根據(jù)試紙上的免疫反應(yīng)發(fā)生結(jié)果，即膠體金位置是否有紅色條帶出現(xiàn)判斷檢測結(jié)果。
該方法無需特殊處理標(biāo)本，僅需一滴血即可在15 min內(nèi)通過肉眼觀察獲取檢測結(jié)果，突破了現(xiàn)有檢測技術(shù)對(duì)人員、場所的限制，縮短檢測時(shí)間，操作方便快速，在基層醫(yī)療單位及現(xiàn)場檢測中廣泛使用。目前針對(duì)新型冠狀病毒，已經(jīng)報(bào)道的有兩種膠體金試紙，一種是檢測新型冠狀病毒的抗原-雙抗體夾心法，另一種是檢測患者血液里特異性針對(duì)新型冠狀病毒的IgM抗體-IgM捕捉法。在疫情爆發(fā)期，需要大規(guī)模做陽性檢測時(shí)，適合使用總抗檢測，同時(shí)聯(lián)卡操作也比較簡單，只需要操作一次，而分開檢測需要滴加兩次樣，用兩次卡。
化學(xué)發(fā)光免疫分析法是將高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合，用于各種抗原、抗體、激素等檢測。該法靈敏度高于 ELISA，具有特異性強(qiáng)、線性范圍寬、結(jié)果穩(wěn)定、操作簡化等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于臨床標(biāo)本的檢測。但是該方法對(duì)設(shè)備、操作、使用環(huán)境的要求比較高，使用時(shí)需要配套的化學(xué)發(fā)光儀器。
抗體檢測的靈敏度和特異度:靈敏度反映診斷試驗(yàn)檢出感染者的能力，若過低，會(huì)出現(xiàn)較多假陰性結(jié)果，影響疾病的診斷、干預(yù)和預(yù)后，嚴(yán)重可導(dǎo)致患者過早死亡；特異度衡量診斷試驗(yàn)正確判斷非感染者的能力，若過低，則會(huì)出現(xiàn)較多假陽性結(jié)果，導(dǎo)致醫(yī)療資源的浪費(fèi)，并造成患者及群眾的焦慮和恐慌。因此，具有較高靈敏度和特異度是抗體檢測技術(shù)的應(yīng)用基礎(chǔ)。
三
不同檢測方法優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比
與抗體血清學(xué)檢測相比，核酸檢測能夠檢測到處于窗口期的患者，及早發(fā)現(xiàn)感染者，是新型冠狀病毒檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是對(duì)檢測設(shè)備或平臺(tái)要求較高，高靈敏度的RT-PCR儀價(jià)格昂貴，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的潔凈度和操作人員要求也較高。此外，核酸檢測耗時(shí)較長，考慮到樣本運(yùn)輸、樣本積壓的情況，通常最快24小時(shí)才可以報(bào)告結(jié)果。
與核酸檢測相比，抗體血清學(xué)檢測的血液標(biāo)本更易獲取且標(biāo)本質(zhì)量有保證、操作簡單快捷、很大程度上降低了醫(yī)護(hù)人員在標(biāo)本采集和檢測過程中被感染的風(fēng)險(xiǎn)、更易于基層實(shí)驗(yàn)室展開篩查工作等。如果說核酸檢測病毒的核糖核酸（RNA），是病毒存在的直接證據(jù)，那么抗體檢測的就是患者血液中被刺激產(chǎn)生的抗體，是間接證據(jù)，對(duì)臨床有提示作用。當(dāng)核酸檢測陰性時(shí)，將IgM和IgG抗體檢測增加進(jìn)去，可以彌補(bǔ)核酸檢測容易造成漏診的缺點(diǎn)。
目前市場上主流的抗體檢測方法學(xué)是化學(xué)發(fā)光，但化學(xué)發(fā)光平臺(tái)對(duì)設(shè)備、操作、使用環(huán)境的要求比較高。對(duì)比核酸檢測，化學(xué)發(fā)光的核心優(yōu)勢就是取樣及操作簡易，但沒有快速檢測的優(yōu)勢。針對(duì)于普通篩查或者說針對(duì)于非發(fā)達(dá)國家，膠體金檢測方法對(duì)人員、場地、設(shè)備要求都非常低，適用于大規(guī)模的快速檢測。國際企業(yè)如羅氏、雅培等在膠體金方面是沒有技術(shù)儲(chǔ)備的，實(shí)際上全球的膠體金檢測（包括新冠肺炎、傳染病、流感、瘧疾、性病等）大部分的供應(yīng)量還是在中國。
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