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隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是免疫學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，新的細(xì)菌診斷技術(shù)和方法已廣泛用于食品微生物的鑒別。傳統(tǒng)的細(xì)菌分離、培養(yǎng)及生化反應(yīng)，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足對(duì)各種病原微生物的診斷以及流行病學(xué)的研究。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者不斷努力，已創(chuàng)建不少快速、簡(jiǎn)便、特異、敏感、低耗且適用的細(xì)菌學(xué)診斷方法，尤其是DNA探針和多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，明顯提高了細(xì)菌的診斷水平。
一、快速酶觸反應(yīng)及細(xì)菌代謝產(chǎn)物的檢測(cè)
快速酶觸反應(yīng)是根據(jù)細(xì)菌在其生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中可合成和釋放某些特異性的酶，按酶的特性，選用相應(yīng)的底物和指示劑，將他們配制在相關(guān)的培養(yǎng)基中。根據(jù)細(xì)菌反應(yīng)后出現(xiàn)的明顯的顏色變化，確定待分離的可疑菌株，反應(yīng)的測(cè)定結(jié)果有助于細(xì)菌的快速診斷。這種技術(shù)將傳統(tǒng)的細(xì)菌分離與生化反應(yīng)有機(jī)的結(jié)合起來(lái)，并使得檢測(cè)結(jié)果直觀，正成為今后微生物檢測(cè)發(fā)展的一個(gè)主要發(fā)展方向。Rosa等將樣本直接接種于Granda培養(yǎng)基，經(jīng)18小時(shí)培養(yǎng)后，B群鏈球菌呈紅色菌落且可抑制其他菌的生長(zhǎng)。
Delise等新合成一種羥基吲哚-β-D葡萄糖甘酸（IBDG），在β-D葡萄糖苷酶的作用下，生成不溶性的藍(lán)，將一定量的IBDG加入到麥康蓋培養(yǎng)基瓊脂中制成MAC-IBDG平板，35℃培養(yǎng)18小時(shí)，出現(xiàn)深藍(lán)色菌落者為大腸埃希氏陽(yáng)性菌株。其色彩獨(dú)特，且靛藍(lán)不易擴(kuò)散，易與乳糖發(fā)酵菌株區(qū)別。
二、免疫學(xué)方法檢測(cè)細(xì)菌抗原或抗體的技術(shù)
在細(xì)菌診斷中利用免疫學(xué)的各種方法日益受到人們的極大關(guān)注，從而簡(jiǎn)化了病原微生物的鑒定手續(xù)。
1．抗血清凝集技術(shù)
早在1933年，Lancefield就成功地用多價(jià)血清對(duì)鏈球菌進(jìn)行了血清分型。隨著抗體制備技術(shù)的進(jìn)一步完善，尤其是單克隆抗體的制備，明顯提高了細(xì)菌凝集實(shí)驗(yàn)的特異性，今天廣泛用于細(xì)菌的分型和鑒定，如沙門氏菌、霍亂弧菌等。
2．乳膠凝集實(shí)驗(yàn)
將特異性的抗體包被在乳膠顆粒上，通過(guò)抗體與相應(yīng)的細(xì)菌抗原結(jié)合，產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的凝集反應(yīng)。通常此法需獲得細(xì)菌純培養(yǎng)物，再將培養(yǎng)物與致敏乳膠反應(yīng)。業(yè)已用于鑒定大腸桿菌O157；H7
3．熒光抗體檢測(cè)技術(shù)
用于快速檢測(cè)細(xì)菌的熒光抗體技術(shù)主要有直接法和間接法。直接法是在檢測(cè)樣品上直接滴加已知特異性熒光標(biāo)記的抗血清，經(jīng)洗滌后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。間接法是在檢樣上滴加已知的細(xì)菌特異性抗體，待作用后經(jīng)洗滌，再加入熒光標(biāo)記的第二抗體。如研制成的抗沙門氏菌熒光抗體，用于750份食品樣品的檢測(cè)，結(jié)果表明與常規(guī)培養(yǎng)法符合率基本一致。
4．協(xié)同凝集試驗(yàn)（COA）
業(yè)已證實(shí)，葡萄球菌A蛋白（SPA）具有與人及各種哺乳動(dòng)物IgG的Fc段結(jié)合的能力，而不影響抗體Fab段的活性。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用抗體致敏的SPA檢測(cè)細(xì)菌即協(xié)同凝集試驗(yàn)。如Rahman等用協(xié)同凝集試驗(yàn)鑒定霍亂弧菌O1群的初代分離物做快速篩選，比常規(guī)法節(jié)省時(shí)間，對(duì)204份材料用兩種方法比較表明協(xié)同凝集試驗(yàn)具有較高的特異性和敏感性。
5．酶聯(lián)免疫測(cè)試技術(shù)
酶聯(lián)免疫技術(shù)的應(yīng)用，大大提高了檢測(cè)的敏感性和特異性，現(xiàn)已廣泛地應(yīng)用在病原微生物的檢驗(yàn)。
應(yīng)用酶聯(lián)免疫技術(shù)制造的mini-Vidas全自動(dòng)免疫分析儀，是用熒光分析技術(shù)通過(guò)固相吸附器，用已知抗體來(lái)捕捉目標(biāo)生物體，然后以帶熒光的酶聯(lián)抗體再次結(jié)合，經(jīng)充分沖洗，通過(guò)激發(fā)光源檢測(cè)，即能自動(dòng)讀出發(fā)光的陽(yáng)性標(biāo)本，其優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)靈敏度高，速度快，可以在48小時(shí)的時(shí)間內(nèi)快速鑒定沙門氏菌、大腸桿菌O157：H7、單核李斯特菌，空腸彎曲桿菌和葡萄球菌腸毒素等。
三、分子生物學(xué)技術(shù)在檢測(cè)食源性病原微生物中的應(yīng)用
隨著分子微生物生物學(xué)和分子化學(xué)的飛速發(fā)展，對(duì)病原微生物的鑒定已不再局限于對(duì)它的外部形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理特性等一般檢驗(yàn)上，而是從分子生物學(xué)水平上研究生物大分子，特別是核酸結(jié)構(gòu)及其組成部分。在此基礎(chǔ)上建立的眾多檢測(cè)技術(shù)中，核酸探針(Nuclear acid probe)和聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction)以其敏感、特異、簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)成為世人矚目的生物技術(shù)革命的新產(chǎn)物，業(yè)已逐步應(yīng)用于食源性病原菌的檢測(cè)。
1．核酸探針
將已知核苷酸序列DNA片段用同位素或其他方法標(biāo)記，加入已變性的被檢DNA樣品中，在一定條件下即可與該樣品中有同源序列的DNA區(qū)段形成雜交雙鏈，從而達(dá)到鑒定樣品中DNA的目的，這種能認(rèn)識(shí)到特異性核苷酸序列有標(biāo)記的單鏈DNA分子核酸探針或基因探針。
2．核酸探針的類型
根據(jù)核酸探針中核苷酸成分的不同，可將其分成DNA探針或RNA探針，一般大多選用DNA探針；根據(jù)選用基因的不同分成兩種，一種探針能同微生物中全部DNA分子中的一部分發(fā)生反應(yīng)，它對(duì)某些菌屬、菌種、菌株有特異性，另一種探針只能限制性同微生物中某一基因組DNA 發(fā)生雜交反應(yīng)，如編碼致病性的基因組，它對(duì)某種微生物中的一種菌株或僅對(duì)微生物中某一菌屬有特異性。這類探針檢測(cè)的基因相當(dāng)保守，包括大部分rRNA，因?yàn)樗瓤赡茉谝环N微生物中出現(xiàn)，又可代表一群微生物。如應(yīng)用rRNA探針檢測(cè)作為篩選食品污染程度的指示菌E.Coli.選擇探針的原則是只能同檢測(cè)的細(xì)菌發(fā)生雜交反應(yīng)，而不受非檢菌存在的干擾。
3．核酸探針的應(yīng)用：
�。�1）．用于檢測(cè)無(wú)法培養(yǎng)，不能用作生化鑒定、不可觀察的微生物產(chǎn)物以及缺乏診斷抗原等方面的檢測(cè)，如腸毒素。
�。�2）．用于檢測(cè)同食源性感染有關(guān)的病毒病，如檢測(cè)肝炎病毒，流行病學(xué)調(diào)查研究，區(qū)分有毒和無(wú)毒菌株。
�。�3）．檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)抗藥基因。
�。�4）．分析食品是否會(huì)被某些耐藥菌株污染，判定食品污染的特性。
（5）．細(xì)菌分型，包括rRNA分型。
4、核酸探針的特點(diǎn):
4.1.探針的特異性:探針檢測(cè)技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)是特異性，就是說(shuō)一個(gè)適當(dāng)組建的DNA探針能絕對(duì)特異性地與所檢微生物而不與其他微生物發(fā)生反應(yīng)。對(duì)食品檢測(cè)而言，就是不與樣品中內(nèi)源性雜菌和樣品自身DNA發(fā)生非特異性反應(yīng)。
以往檢測(cè)方法檢測(cè)的是基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)或其他產(chǎn)物）。檢測(cè)這種物質(zhì)受多種因素影響。比如食品中微生物因受應(yīng)激損傷（高溫、冷凍、化學(xué)制劑等）會(huì)導(dǎo)致基因組的變化，從而引起其表達(dá)產(chǎn)物的變化。而核酸探針檢測(cè)的是基因本身，它能識(shí)別基因本身的變異，不受基因表達(dá)產(chǎn)物的影響。常規(guī)免疫學(xué)方法檢測(cè)抗原、抗體，它們都是蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)由氨基酸組成，而氨基酸由核苷酸序列確定，一旦這種序列受外界影響發(fā)生變異，就會(huì)導(dǎo)致其產(chǎn)物的變化，影響抗原抗體間的反應(yīng)，使檢測(cè)特異性下降。
檢測(cè)病毒主要通過(guò)組織培養(yǎng)后，檢測(cè)病毒相關(guān)的蛋白質(zhì)囊膜，即使采用超低溫保存，有時(shí)也會(huì)引起編碼蛋白質(zhì)囊膜基因的變化，而采取DNA探針檢測(cè)病毒則不用改變其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，而只需檢測(cè)是否有相應(yīng)特異性的編碼蛋白質(zhì)囊膜的病毒靶DNA序列。
另外，核酸之間的識(shí)別連接比抗原抗體準(zhǔn)確，并且探針檢測(cè)比免疫學(xué)方法靈活。盡管看來(lái)形成抗原抗體復(fù)合物比核酸雜交快，但能通過(guò)加磺化葡聚糖把退火速度增加100倍，從而提高反應(yīng)速度，核酸比蛋白質(zhì)耐受高溫（100℃）、有機(jī)溶劑、螯合劑和高濃度工作液的破壞能力強(qiáng)，所以用比提取制備蛋白質(zhì)強(qiáng)烈的多的方法制備核酸，不會(huì)影響雜交反應(yīng)。當(dāng)然RNA探針除外，因?yàn)镽NA不耐受堿處理，需用其它方法制備檢測(cè)用RNA。
核酸探針的特異性取決于探針的堿基序列和使用條件，如在不嚴(yán)格的條件下（低溫高鹽）探針與靶DNA誤交結(jié)合力比嚴(yán)格條件下穩(wěn)定。
探針長(zhǎng)度也會(huì)影響反應(yīng)的特異性，一般加Formamide增強(qiáng)反應(yīng)特異性。
4．2．探針的敏感性
研制核酸探針是為了檢測(cè)出單個(gè)病毒和細(xì)菌。DNA探針敏感性取決于探針本身和標(biāo)記系統(tǒng)。32P標(biāo)記物通常可檢出10-8摩爾特異DNA片段，相當(dāng)于0。5pg,1000個(gè)堿基對(duì)的靶系列，相當(dāng)于1000---10000個(gè)細(xì)菌。用親和素標(biāo)記探針檢測(cè)1小時(shí)培養(yǎng)物DNA含量在110pg，兩者敏感性大致相同，而血清學(xué)方法只能達(dá)到1ng的水平。
延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度能提高探針的敏感性。
非放射性物標(biāo)記探針在高濃度情況下，由于抑制了非特異性吸附，比放射性物標(biāo)記探針背景干擾小。
制備食品樣品時(shí)，因機(jī)械均漿而導(dǎo)致菌體破裂，產(chǎn)生較高的背景干擾會(huì)影響檢測(cè)敏感性。
在探針上加生物素化的核苷酸長(zhǎng)尾能使檢測(cè)敏感性提高10倍。
細(xì)胞中rRNA比DNA多，檢測(cè)rRNA的探針比DNA敏感。通過(guò)擴(kuò)增DNA含量也能提高檢測(cè)敏感性。
4．3．探針檢測(cè)技術(shù)中存在的問(wèn)題
檢測(cè)一種菌就需要制備一種探針，目前尚未建立所有致病菌的探針，盡管檢測(cè)速度快，但要達(dá)到檢測(cè)量還要對(duì)樣品進(jìn)行一定時(shí)間的培養(yǎng)，任何一種方法不可能有100%的特異性和敏感性，所以必須考慮假陽(yáng)性和假陰性的問(wèn)題。
DNA探針還不能完全取得常規(guī)檢驗(yàn)提供的細(xì)菌特性的信息，如在菌株生物型鑒定、血清型和抗藥基因上有不足之處。
檢測(cè)食品時(shí)，樣品中待檢菌量低雜質(zhì)成分復(fù)雜，樣品DNA純度不夠高等都會(huì)限制探針檢測(cè)的敏感性。
探針檢測(cè)是分析基因序列，對(duì)毒素污染的食品有時(shí)因樣品中不含產(chǎn)毒菌而無(wú)法檢測(cè)，因?yàn)楸M管探針能檢測(cè)活菌或死菌中存在的靶DNA序列，但它不能檢測(cè)其表達(dá)產(chǎn)物，所以在評(píng)價(jià)食品安全衛(wèi)生上存在一定的局限性。
5．核酸探針雜交技術(shù)原理
根據(jù)完成雜交反應(yīng)所處介質(zhì)的不同，分成固相雜交反應(yīng)和液相雜交反應(yīng)。固相雜交反應(yīng)是在固相支持物上完成的雜交反應(yīng)，如常見(jiàn)的印跡法和菌落雜交法。事先破碎細(xì)胞使之釋放DNA/RNA然后把裂解獲得的DNA/RNA固定在硝基纖維素薄膜上，再加標(biāo)記探針雜交，依顏色變化確定結(jié)果，該法是最原始的探針雜交法容易產(chǎn)生非特異性背景干擾。
液相雜交法指雜交反應(yīng)在液相中完成，不需固相支持，優(yōu)點(diǎn)是雜交速度比固相雜交反應(yīng)速度快5�10倍。缺點(diǎn)是為消除背景干擾必需進(jìn)行分離以除去加入反應(yīng)體系中的干擾劑。
分離雜交DNA探針的方法有兩種，一種用羥磷灰石，它僅能與雙股DNA結(jié)合，單股DNA在和羥磷灰石結(jié)合前必須先同一個(gè)探針或互補(bǔ)單鏈雜交成雙股DNA才可。當(dāng)溶液中DNA通過(guò)羥磷灰石柱子時(shí)，只有雙股DNA能吸附，然后再把吸附在柱上的DNA洗脫下來(lái)，最后用激活的標(biāo)記物檢測(cè)。另一種分離方法運(yùn)用磁球技術(shù)把探針與小磁球連接，再用多核苷酸尾部連接第二探針，不用離心就能分離DNA與未雜交DNA。短寡核苷酸能和磁球連接，也能從磁球上洗脫，在以mRNA系統(tǒng)進(jìn)行靶循環(huán)的檢測(cè)過(guò)程中，該方法能將背景干擾降低2---3個(gè)數(shù)量級(jí)，從而達(dá)到較高的敏感性。
5．1．夾心雜交法（Sandwish hybridization）
它由三種不同作用的核酸成分組成：（1）：與固相支持物連接的捕獲探針；（2）產(chǎn)生信號(hào)的檢測(cè)探針；（3）靶核酸序列。靶核酸在這個(gè)體系中起連接捕獲探針和信號(hào)檢測(cè)探針的作用。如體系中存在上述三種成分，靶核酸能于上述兩種核苷酸雜交，洗脫去除雜質(zhì)后能得到一個(gè)清晰的檢測(cè)信號(hào)，如果靶核酸不與上述兩種探針雜交，則信號(hào)探針無(wú)法連接在固相物上，洗脫后固相物上無(wú)信號(hào)應(yīng)答。
5．2．核酸置換雜交分析法 （Strand displacement assay）
它是在夾心雜交法的基礎(chǔ)上改進(jìn)的一種方法。先獎(jiǎng)捕獲探針連接在固相物上，然后在此探針上以微弱的結(jié)合方式雜交一個(gè)短小能產(chǎn)生信號(hào)的核酸，如果靶DNA能與捕獲探針雜交可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)置換出帶信號(hào)的核苷酸片段，在檢測(cè)過(guò)程中產(chǎn)生信號(hào)的單股核酸可轉(zhuǎn)化為ATP，再加入熒光素酶，用生物發(fā)光分析法檢測(cè)。其優(yōu)點(diǎn)在于背景干擾小，敏感性強(qiáng)。缺點(diǎn)為不是所有捕獲探針都能應(yīng)用這種方法雜交，且信號(hào)探針會(huì)不斷地從捕獲探針上脫落。
5．3．浸染棒法 （Dipstick assay）
它是夾心雜交法最新的一種改進(jìn)方法。它用兩種探針，其中一個(gè)進(jìn)行標(biāo)記，另一個(gè)是單核苷酸長(zhǎng)鏈，如多聚腺苷酸。浸染棒上包裹與多聚腺苷酸長(zhǎng)鏈探針能互補(bǔ)配對(duì)的堿基成分，即多聚胸腺嘧啶，盡管雜交反應(yīng)在溶液中完成，但浸染棒是完成最后檢測(cè)的固相支持物。它比薄膜法能更有效地減少背景干擾，提高檢測(cè)效率。亦已用于沙門氏菌和李氏菌的檢測(cè)。對(duì)熒光素標(biāo)記探針可用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記熒光素抗體，通過(guò)比色法檢測(cè)復(fù)合物濃度。
6.聚合酶技術(shù)（PCR）的原理及其發(fā)展
6．1．PCR技術(shù)原理
為提高DNA探針的敏感性，可先將靶DNA序列擴(kuò)增，增加DNA數(shù)量，使其達(dá)到足夠的檢測(cè)量，若反應(yīng)以動(dòng)力學(xué)為基礎(chǔ)，則能定量分析。1983年Millus 和Cetus發(fā)明了最基本的擴(kuò)增DNA或增加樣品中特殊核苷酸片段數(shù)量的方法·聚合酶鏈反應(yīng)即PCR法。PCR法建立在三步重復(fù)發(fā)生反應(yīng)的基礎(chǔ)上。①通過(guò)熱處理將雙股DNA變性裂解成單股DNA；②退火延伸引物至特異性寡核苷酸上；③酶促延伸引物與DNA配對(duì)合成模板，引物退火，變性DNA片段，引物雜交形成的模板可參與再次反應(yīng)。溶液中核苷酸通過(guò)酶聚合成相互補(bǔ)對(duì)的DNA片段，并能重新裂解成單股DNA，成為下次PCR復(fù)制的模板。因此每次循環(huán)特異性DNA將以雙倍量增加。典型擴(kuò)增經(jīng)過(guò)20�40次循環(huán)能引起100萬(wàn)倍的擴(kuò)增。在PCR反應(yīng)中引入Taq聚合酶使反應(yīng)得以半自動(dòng)化和簡(jiǎn)便反應(yīng)程序。用擴(kuò)增DNA進(jìn)行的PCR反應(yīng)具有無(wú)與倫比的優(yōu)越性。如用同位素標(biāo)記兩種基因（Lac Z 和 Lam B）的，探針做PCR反應(yīng)檢測(cè)水源中E.Coli，檢測(cè)量達(dá)到1�5 個(gè)細(xì)菌/100ml。為快速準(zhǔn)確的檢測(cè)食品中污染的病原微生物帶來(lái)一線曙光。
當(dāng)然PCR也存在缺點(diǎn)，主要是系統(tǒng)容易受外源DNA的污染，并隨樣品中待檢DNA一起擴(kuò)增。特別是1990年Bottger發(fā)現(xiàn)某些Taq聚合酶被外源性DNA物質(zhì)污染。另外試驗(yàn)中需要一定的特殊設(shè)備和熟練的操作技術(shù)，尚不能全自動(dòng)化，需要花勞力制備待檢樣品。
6．2．Qβ復(fù)制酶法
Gene-Tark改良了PCR方法，建立了Qβ復(fù)酶系統(tǒng)擴(kuò)增法。這種命名是根據(jù)反應(yīng)過(guò)程中起擴(kuò)增作用的酶來(lái)確定的。通過(guò)探針與靶DNA相結(jié)合，系統(tǒng)以酶學(xué)方法促進(jìn)擴(kuò)增。該探針是含有一個(gè)模板區(qū)域的RNA探針，其三級(jí)結(jié)構(gòu)稱作MDV1。系統(tǒng)含有RNA指導(dǎo)的RNA聚合酶、Qβ和復(fù)制酶。擴(kuò)增MDV-1的速度很快。每循環(huán)一次需15-20秒，共循環(huán)15-30分鐘。千分之一含量的RNA可擴(kuò)增到125-200ng，一億倍擴(kuò)增。由于大量合成RNA，用簡(jiǎn)單的比色法就能檢測(cè)雜交反應(yīng)。反應(yīng)呈動(dòng)力學(xué)特征，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定初始結(jié)合物濃度，就可做定量分析。缺點(diǎn)是酶易受污染，導(dǎo)致敏感性下降，背景干擾限制了方法的實(shí)際應(yīng)用。
6.3．連續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)法（Lar）
Lar是在PCR基礎(chǔ)上的又一種改進(jìn)，同PCR不同之處在于它不擴(kuò)增單個(gè)核苷酸形成DNA分子，而是用一種稱作T4DNA連接酶把兩個(gè)寡核苷酸彼此相連。通過(guò)連接酶的作用，兩者能相互交聯(lián)，在這種情況下，同PCR反應(yīng)一樣，連結(jié)的寡核苷酸沿原始系列排列，并成為下次循環(huán)的模板。循環(huán)20-30次可把原始靶DNA含量增加100萬(wàn)倍。但它需對(duì)整個(gè)靶DNA序列事先有明確了解，否則一個(gè)堿基錯(cuò)配就會(huì)導(dǎo)致寡核苷酸相互連結(jié)的失敗。
6.4．轉(zhuǎn)錄放大系統(tǒng)（TAS/3SR/NASBATM）
1989年Kwoh等介紹了一種新技術(shù)，轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增系統(tǒng)（TAS），它是包括DNA合成和RNA轉(zhuǎn)錄的雙重循環(huán)過(guò)程。它以變性DNA和一般RNA為引物的寡核苷酸靶序列，這個(gè)寡核苷酸上包含多聚酶結(jié)合部和與靶序列互補(bǔ)配對(duì)的片段。雜交時(shí)，引物與靶序列結(jié)合，反轉(zhuǎn)錄酶延伸引物與靶序列互相配對(duì)，熱變性后，另外一個(gè)寡核苷酸退火成新股DNA。再加入反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生與新股DNA互補(bǔ)的雙股DNA。并延伸原始的已退火的引物至另外一個(gè)靶序列上。加入RNA聚合酶，可以擴(kuò)增RNA的拷貝數(shù)（10-1000）。因此方法僅需4次循環(huán)就能得到RNA分子1,000,000個(gè)拷貝數(shù)。
1990年Gualelli修正了TAS法，設(shè)計(jì)了一種稱作自我片段復(fù)制擴(kuò)增系統(tǒng)（3SR）。3SR與TAS不同之處在于，3SR是等溫反應(yīng)（37°-42°），需要降解RNA靶序列。如果包括最初變性這一步，3SR方法還是需要擴(kuò)增DNA，RNaseH用于降解在TAS反應(yīng)中形成的RNA-DNA雜合物，并轉(zhuǎn)化成雙股DNA。在雙股DNA的每一末端都含有一個(gè)聚合酶結(jié)合部，雙股DNA繼續(xù)循環(huán)并作為合成RNA的模板，再次參加反應(yīng)過(guò)程。15分鐘就能放大100，000個(gè)拷貝。而PCR法即使有100%擴(kuò)增效果也需要85分鐘才能取得同樣結(jié)果。
與PCR相比它不用熱循環(huán)，因此不必調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度，所有反應(yīng)在一個(gè)反應(yīng)管中完成。另外3SR能區(qū)分DNA和RNA，同其它擴(kuò)增反應(yīng)一樣，3SR易受外源核酸的污染。由于反應(yīng)所需的酶多，并且與其它方法相比，反應(yīng)嚴(yán)格性低，所以特異性較差。
1989年Cangene發(fā)明了核酸片段擴(kuò)增法（NASBMTM），此法已獲得歐洲專利。據(jù)報(bào)導(dǎo)它能將100個(gè)分子的DNA擴(kuò)增到100ug。
6.5．放大信號(hào)檢測(cè)法
放大信號(hào)同時(shí)能改善DNA探針的敏感性。有些學(xué)者研究處用腺嘌呤酯標(biāo)志DNA的生物化學(xué)檢測(cè)方法，反應(yīng)初始時(shí)需加入H2O2，酯結(jié)構(gòu)的破壞會(huì)產(chǎn)生光，光亮強(qiáng)度與存在的靶DNA含量成比例關(guān)系，也有人用一種稱作磷酸苯二氧化物做生物發(fā)光劑，有報(bào)導(dǎo)稱，此物質(zhì)在堿性磷酸酶作用下轉(zhuǎn)化為發(fā)光物質(zhì)，用比色法檢測(cè)它比OPD和HRP敏感10倍以上。1989年Mclaprae介紹了用化學(xué)顯影學(xué)致敏劑作為標(biāo)記物，加熱后，能釋放出光，用固相薄膜檢測(cè)能增加敏感性，生物化學(xué)發(fā)光法在DNA探針檢測(cè)上效果很好。
最近推崇非同位素的標(biāo)記物是酶標(biāo)抗體。標(biāo)記抗體能與共價(jià)結(jié)合的DNA探針標(biāo)記物相結(jié)合。如在探針尿嘧啶殘基上標(biāo)記熒光素，再用高度親和力的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗熒光素抗體檢測(cè)原始探針。胞嘧啶磺化物或在鳥(niǎo)嘌呤上引入2-乙酰氨基熒光素及其衍生物也能替代熒光素和酶連結(jié)抗體。
另一種途徑是把非活性的S-肽從核糖核酸酶上連結(jié)到DNA探針上，雜交后，加入S-蛋白，可重新構(gòu)建功能酶。再循環(huán)酶放大系統(tǒng)中檢測(cè)活化的核糖核酸酶。
現(xiàn)又研究出一種新方法，它是把探針切成兩半，每半標(biāo)記兩種不同的能相互聯(lián)結(jié)的熒光物質(zhì)或酶系統(tǒng)成分中的一種。當(dāng)兩種探針雜交相互靠近時(shí)，激活能量狀態(tài)的熒光物質(zhì)轉(zhuǎn)移到鄰近的熒光物質(zhì)或酶系統(tǒng)受體上，而激活受體產(chǎn)生信號(hào)。反應(yīng)過(guò)程不用進(jìn)行分離，因?yàn)槿魶](méi)有發(fā)生雜交反應(yīng)，兩種成分不能相互靠近，不會(huì)產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)。
7.分子生物學(xué)技術(shù)在食源性病原菌檢測(cè)上的應(yīng)用：
7.1.沙門氏菌
食品中沙門氏菌污染量小，常受應(yīng)激損傷，不易恢復(fù)，現(xiàn)用檢測(cè)方法得到陰性報(bào)告最少需四天，陽(yáng)性報(bào)告還要延遲2-3天。研究檢測(cè)沙門氏菌的探針難度大，因?yàn)樗鼡碛?000多個(gè)血清型，還不清楚它們是否存在共同特異性的致病因子。Fillal等人從染色體序列和構(gòu)建的質(zhì)粒文庫(kù)中分離到一個(gè)適用于沙門氏菌檢測(cè)的探針。它能和沙門氏菌而不和其他微生物及樣品培養(yǎng)基發(fā)生非特異性反應(yīng)。這種用同位素標(biāo)記的探針，能識(shí)別350株不同的沙門氏菌。由于該方法最小檢出量只有1個(gè)細(xì)菌/25克樣品，所以需要增菌培養(yǎng)。
AOAC最近認(rèn)可了Gene-Tark沙門氏菌比色分析法。這種探針標(biāo)記物為異硫氰酸熒光素（FITC），再用辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記抗FITC的抗體結(jié)合放大探針，在多聚腺苷酸尾部和多聚胸腺嘧啶侵染棒固相薄膜上雜交，對(duì)239株沙門氏菌的特異性檢出率為100%，假陽(yáng)性率為0.8%（BAM/AOAC培養(yǎng)法假陽(yáng)性率是2.2%。）
7.2李斯特桿菌
1981年首次確定它是一種食源性病原菌，1985年加尼福利亞發(fā)生爆發(fā)性流行，現(xiàn)用檢測(cè)方法大多采用冷增菌，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。
FDA于1987年最新研制出針對(duì)李斯特菌致病基因β�溶血素的探針，隨后GENE-TARK研制出商品化檢測(cè)李斯特菌的DNA探針，它能特異性識(shí)別細(xì)菌的16SrRNA。該探針是由人工合成的寡核苷酸，用比色法檢測(cè)樣品需先在LEB中培養(yǎng)16�22h，然后侵染比色檢測(cè)，假陰性率為0.8�4.7%（常規(guī)法為1.4�2.9%。）
1989年Bessesea等運(yùn)用擴(kuò)增李斯特菌溶血素基因中386bp的PCR方法檢測(cè)單核細(xì)胞增生型李斯特菌，DNA檢測(cè)量低于25ng，即少于1000個(gè)菌體，特異性強(qiáng)，能檢測(cè)出50株不同的單核李斯特菌，而不與12株非單核李斯特菌和12種非李斯特菌屬的細(xì)菌發(fā)生反應(yīng)。
7.3.弧菌
關(guān)于用DNA探針檢測(cè)溶血性弧菌中溶血基因的報(bào)導(dǎo)很多。國(guó)外對(duì)DNA探針和單克隆抗體法在檢測(cè)鞭毛抗原方面作了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNA探針?lè)?yáng)性檢出率高。近年來(lái)用PCR擴(kuò)增DNA片段，再做探針檢測(cè)，能檢出新鮮龍蝦仁中的弧菌，檢測(cè)敏感性為10個(gè)細(xì)菌/克，但要用凝膠電泳進(jìn)一步鑒定。因此，不太合適檢測(cè)食品。1989年Olive構(gòu)建了一個(gè)熱穩(wěn)定溶血素基因的寡核苷酸DNA探針檢測(cè)付溶血弧菌。
7.4.志賀氏菌
目前志賀氏菌檢測(cè)方法存在著質(zhì)粒容易丟失和受內(nèi)源菌干擾的問(wèn)題。用核酸探針檢測(cè)可克服上述缺陷�，F(xiàn)采用人工合成32P標(biāo)記的寡核苷酸探針在固定薄膜上做菌落雜交檢測(cè)志賀氏菌和侵襲性大腸桿菌（EIEC），也有人用PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)志賀氏菌和（EIEC）。PCR擴(kuò)增前需將福氏痢疾菌擴(kuò)增培養(yǎng)到10000個(gè)/ml，增菌后檢測(cè)需6�7小時(shí)才能得到結(jié)果。敏感性為≤1個(gè)細(xì)菌/克。但PCR擴(kuò)增后需做凝膠電泳進(jìn)一步鑒定，對(duì)常規(guī)檢測(cè)來(lái)講太繁瑣。
7.5．耶爾森氏菌
Hill等研制出針對(duì)同耶爾森氏菌侵襲性質(zhì)粒有關(guān)的DNA探針。用菌落雜交法對(duì)人工污染食品所做試驗(yàn)敏感性明顯地受內(nèi)源菌的影響。近年來(lái)，有人人工合成了一個(gè)24bp的寡核苷酸探針。它是針對(duì)侵襲性質(zhì)粒DNA中一部分的探針，用它檢測(cè)各種食品中耶爾森氏菌，發(fā)現(xiàn)，盡管無(wú)法區(qū)分無(wú)毒菌株且檢測(cè)限量不理想，但能檢測(cè)出10000－100000個(gè)細(xì)菌/克樣品。樣品中內(nèi)源性細(xì)菌對(duì)試驗(yàn)方法沒(méi)干擾。1989年Feng.P等研制針對(duì)由染色體編碼的耶爾森氏菌侵襲性基因的DNA探針。
7.6.彎曲桿菌
檢測(cè)彎曲桿菌的探針是用非放射性物質(zhì)標(biāo)記的。標(biāo)記物為發(fā)光素。靶順序?yàn)閞RNA。近來(lái)用堿性磷酸酶標(biāo)記人工合成的寡核苷酸檢測(cè)人工污染的糞便樣品，檢測(cè)量為100000個(gè)菌落形成單位（CFU），敏感性和特異性達(dá)100%。
探針對(duì)空腸彎曲桿菌的最低檢測(cè)量為20000至800000個(gè)活菌。由于糞便成分復(fù)雜，影響敏感性，此方法只在臨床檢測(cè)中應(yīng)用，尚未用于食品檢測(cè)。
7.7.葡萄球菌
大多數(shù)檢測(cè)葡萄球菌的探針是針對(duì)腸毒素的。它們能同編碼腸毒素有關(guān)的基因序列雜交，這類探針能檢測(cè)腸毒素A、B、C和E。
最近，GeneTark推出檢測(cè)金黃色葡萄球菌的探針，能半定量樣品中的葡萄球菌，尚未得到AOAC的認(rèn)可。方法采用侵染棒比色法，探針檢測(cè)的基因序列是23srRNA。敏感性100%，假陽(yáng)性率為9.3%，人工污染樣品中沒(méi)有假陽(yáng)性結(jié)果發(fā)生。
7.8.假單胞菌屬
亦已研制出能檢測(cè)從肉品中分離到的DNA基因序列相似的假單胞菌的DNA探針。
7.9.大腸桿菌
大腸桿菌是食品和水源污染糞便的指示菌。Gene�Tark研制出用侵染棒檢測(cè)大腸桿菌中16srRNA的探針。樣品需前增菌處理，以異硫氰熒光素（FITC）標(biāo)記探針，再用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗FITC抗體檢測(cè)雜交復(fù)合物。Hsu等報(bào)導(dǎo)方法特異性（除相近的志賀氏菌外）達(dá)100%，假陽(yáng)性率為1.2%（目前使用的BNM/AOAC法為23.4%）。
七十年代人們認(rèn)識(shí)到，E.coli中某些血清型是致病菌，可作為糞便污染的指示菌。用DNA探針檢測(cè)大腸桿菌腸毒素于1984年得到AOAC的認(rèn)可。近來(lái)研究出用PCR法檢測(cè)不耐熱腸毒素的方法，它可以編碼不耐熱腸毒素基因序列為引物，用PCR法擴(kuò)增相應(yīng)的DNA片段，不擴(kuò)增耐熱腸毒素基因。檢測(cè)量為20個(gè)E.coli/100ul。Sander等構(gòu)建了一個(gè)能檢測(cè)產(chǎn)生與志賀氏菌毒素相同毒素的大腸桿菌菌株（SLTEC）的探針。增菌后能檢測(cè)牛肉和其它食品中是否存有SLTEC。1990年Feng.P等研制出大腸桿菌GUD（β�葡萄糖醛酸酶）基因的探針，GUD是AOAC認(rèn)可的MUG（4�甲基傘形酮�β� D�葡萄糖醛酸），試驗(yàn)中檢測(cè)的酶，現(xiàn)用PCR法擴(kuò)增GUD基因，再用DNA探針雜交。MUG試驗(yàn)（即MUG在GUD作用下釋放出4�甲基�7�羥香豆素，它在長(zhǎng)波紫外光照射下產(chǎn)生蘭色熒光）存在的問(wèn)題是大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)有MUG陰性分離物，包括大腸桿菌O157：H7血清型的所有菌株，而DNA探針證實(shí)GUD基因存在于所有大腸桿菌，包括O157：H7和志賀氏菌菌株中。MUG陰性菌株是由于GUD活性受到分解代謝產(chǎn)物的抑制。Kaspar等報(bào)導(dǎo)GUD抗體能和3/4MUG陰性菌株的提取物反應(yīng)。這表明某些菌株是能產(chǎn)生GUD的，但沒(méi)有活性，這可能是因?yàn)榈孜餆o(wú)法進(jìn)入某些菌株細(xì)胞內(nèi)或產(chǎn)物（4�甲基�7�羥香豆素）不能釋放到外界中。因此使用GUD探針檢測(cè)E.coli比MUG試驗(yàn)準(zhǔn)確。
7.10.病毒
每年因病毒引起的食物中毒約占2�12%，如1982年Norwalk病毒引起美國(guó)5000人患腸胃炎，此外凸隆病毒、柯薩奇病毒、萼狀病毒和細(xì)小病毒也都能引起爆發(fā)性腸胃炎。很久以來(lái)人們就發(fā)現(xiàn)食品中存在致病性病毒，但對(duì)它們的檢測(cè)方法報(bào)導(dǎo)甚少。
食品中病毒檢測(cè)與臨床病毒檢測(cè)不同。因?yàn)槊靠思S樣中約含幾千萬(wàn)個(gè)病毒粒子，而食品中僅有一個(gè)病毒粒子就會(huì)引起疾病。盡管如此，要造成對(duì)人的危害，尚需攝入成千上萬(wàn)的病毒粒子。為保證人類健康，更精確評(píng)價(jià)病毒污染食品的程度，只有用DNA探針技術(shù)才能實(shí)現(xiàn)這一目的。
對(duì)市售食品中病毒種類尚缺乏足夠的研究，大部分學(xué)者只注重對(duì)腸道病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒的研究，其它病毒因方法問(wèn)題尚未詳細(xì)報(bào)導(dǎo)。即便食品中含有病毒，由于它們數(shù)量少，難以從樣品中分離和在細(xì)胞上復(fù)制，實(shí)際上低估了食品中病毒的種類。目前的檢測(cè)方法，需要把病毒沉淀，在細(xì)胞和動(dòng)物上復(fù)制驗(yàn)證。DNA探針技術(shù)已用于檢測(cè)凸隆病毒、腺病毒和細(xì)小病毒，但還沒(méi)有用在食品檢測(cè)上。很難獲得足夠數(shù)量的病毒粒子大大限制了DNA探針技術(shù)在檢測(cè)病毒上的應(yīng)用�？瞻唠s交技術(shù)缺乏足夠的敏感性，而且需事先用PCR擴(kuò)增DNA片段，它只能用于檢測(cè)純培養(yǎng)的病毒。
FDA用合成的DNA探針檢測(cè)因食用貝類食品引起腸炎患者糞樣中的細(xì)小病毒，還用DNA探測(cè)環(huán)境樣品中的甲肝病毒。但尚未發(fā)現(xiàn)用探針檢測(cè)Norwalk病毒的報(bào)導(dǎo)。
四、病原微生物的自動(dòng)化系統(tǒng)
近年來(lái)，隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)病原微生物的鑒定技術(shù)朝著微量化、系列化、自動(dòng)化的方向發(fā)展，從而開(kāi)辟了微生物檢測(cè)與鑒定的新領(lǐng)域。最有代表性的是AMS微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)。
AMS為美國(guó)VITEK廠產(chǎn)品，屬于自動(dòng)化程度高的儀器，由7個(gè)部件組成應(yīng)用一系列小的多孔的聚苯乙烯卡片進(jìn)行測(cè)試，卡片含有干燥的抗菌藥物和生化基質(zhì)，可用于不同的用途，卡片用后可棄去。
操作時(shí)，先制備一定濃度的欲鑒定菌株的菌懸液，然后將菌懸液接種到各種細(xì)菌的小卡上，將其放入具有讀數(shù)功能的孵箱內(nèi)，每隔一定時(shí)間，儀器會(huì)自動(dòng)檢測(cè)培養(yǎng)基的發(fā)酵情況，并換算成能被計(jì)算機(jī)所接受的生物編碼。最后由計(jì)算機(jī)判定，打印出鑒定結(jié)果。
該套系統(tǒng)檢測(cè)卡片為14種，每一種鑒定卡片要含有25種以上的生化反應(yīng)指標(biāo)，基本同常規(guī)檢測(cè)鑒定，檢測(cè)所需時(shí)間4�8小時(shí)，最長(zhǎng)不超過(guò)20小時(shí)。
