此處介紹蔬菜中維生素K1的測定方法（HPLC法）和食物及飼料中水溶性維生素K3（甲萘醌）的測定方法
一、蔬菜中維生素K1的測定方法-HPLC法
1.原理
蔬菜中的維生素K1經(jīng)有機溶劑提取后，經(jīng)失活的磷酸鹽處理過的氧化鋁色譜柱進行凈化，再用液相色譜法將維生素K1分離并進行定性定量測定。
2.適用范圍
本標準適用于各類蔬菜、綠色植物及其干制品中維生素K1的測定。
3. 儀器：
（1） 實驗室常用設備
（2） 打碎機
（3） 202-R型恒溫干燥箱
（4） 色譜柱：為0.8cm×30cm的玻璃柱，底端收縮變細，并裝有活塞，活塞上約1 cm處有一玻璃篩板，篩板孔徑為16～30μm，柱上端膨大為容積約30ml的儲液池。使用前需干燥
（5） 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器
與旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器配套的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶：具塞，圓底，容積為150ml。
（6） 恒溫水浴鍋
（7） 高純氮氣
（8） 高速離心機
與高速離心機配套的小離心管：具塞，容積為1.5～3.0ml。
（9） 紫外分光光度計
（10） HPLC：高效液相色譜儀，帶紫外檢測器
4.試劑
除特殊說明實驗用水為蒸餾水，試劑為分析純，有機溶劑使用前需重新蒸餾。
3.1 無水硫酸鈉：使用前需在150℃的烘箱內(nèi)烘烤4～8小時，以去除水分。
3.2 0.14mol/L Na2SO4溶液：稱取20g無水硫酸鈉，用蒸餾水溶解后定容至1L。
3.3 丙酮：分析純。
3.4 石油醚：沸程30～60℃，分析純。
3.5 0.6mol/L碘化鉀溶液：稱取10g碘化鉀，用蒸餾水溶解定容至100ml。
3.6 5g/L淀粉液：稱取0.5g可溶性淀粉，用水溶解定容至100ml。
3.7 乙醚：分析純。不含過氧化物。
（1） 過氧化物的檢查方法：用5ml乙醚加1ml0.6mol/L碘化鉀溶液，振搖1min，如有過氧化物則放出游離碘，水層呈黃色�；蚣�4滴5g/L淀粉液，水層呈藍色。則該乙醚含有過氧化物需處理后使用。
（2） 去除過氧化物的方法：重蒸時瓶中加一段純鐵絲，棄去10%初餾液和10%殘留液。
3.8 洗脫液：石油醚+乙醚（97+3）。
3.9 甲醇：優(yōu)級純。
3.10 正己烷：優(yōu)級純。
3.11 磷酸氫二鈉：分析純。
3.12 中性氧化鋁：100～200目。
3.13 氧化鋁的處理：
（1） 磷酸鹽處理氧化鋁：取250g中性氧化鋁，20g磷酸氫二鈉，1.6L蒸餾水，放入容積為2L的錐形瓶中沸水浴30min，不時搖動或攪拌。冷卻，倒掉上層液體（包括懸浮的細小顆粒），然后用布氏漏斗抽濾。將殘留物轉(zhuǎn)至平底玻璃皿中，于150℃干燥箱中烘烤3～5h至兩次稱量相差3g以下，烘烤過程中不時攪拌，以避免結(jié)塊，冷卻后放入干燥器中保存。
（2） 失活處理氧化鋁：使用前，將磷酸鹽處理的氧化鋁，加入具塞錐形瓶中。每100g氧化鋁加9.0ml去離子水，蓋緊瓶塞，蒸汽浴或80℃干燥箱加熱3～5min，劇烈搖動錐形瓶，使氧化鋁可以自由流動，無結(jié)塊。冷卻，靜置30分鐘，使水分分布均勻。
（3） 驗證處理過的氧化鋁：取標準應用液1.0ml，用氮氣吹干，再用石油醚溶解定容至1.0ml。然后按5.3裝柱，將標準溶液加入柱上，按5.4凈化步驟進行柱色譜，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶收集洗脫流出液，濃縮，氮氣吹干，用正己烷定容至1.0ml，HPLC測定，記錄峰面積或峰高（A）。另取標準應用液直接測定，記錄峰面積或峰高（Ar）。將A與Ar進行比較，其值在0.97～1.03之間（A/Ar），則說明柱效較好，氧化鋁處理合格。否則需重新進行失活處理。如果再次驗證比值仍不能達到0.97，則需重新制備氧化鋁。
3.14 維生素K1標準：Sigma公司，純度>98%。
3.15 標準貯備液：精確稱取50.0mg維生素K1標準，用正己烷溶解定容至50.0ml，即1.0mg/ml。將儲備液分裝成安瓿，冷凍保存。
3.16 標準工作液：取標準貯備液， 用正己烷準確稀釋50倍, 即20.0μg/ml。
標準工作液的標定：取標準應用液測定紫外吸光值，波長248nm，比色杯厚度1cm，以正己烷為空白，測定3次，取平均值，按下式計算標準應用液濃度。
所有操作均需避光進行
5.1 樣品處理
（1） 新鮮蔬菜：揀凈去雜物，將可食部洗凈，擦去表面水分，切碎，用打碎機制備成勻漿。
（2） 干制植物性樣品：磨碎,過60目篩。
5.2 樣品提取
（1） 稱取已打成勻漿的新鮮樣品2～10g（維生素K1含量不低于2μg），加到具塞錐形瓶中,再加入5～10倍體積的丙酮,蓋上塞子,振搖3～5min，靜置1min，以下按5.3步驟操作。
（2） 稱取干制植物性樣品0.2～4g（維生素K1含量不低于2μg）,加到研缽中，再加入2～4倍于樣品量的無水Na2SO4研磨均勻后,加入25ml丙酮,研磨3～5min，靜置1min。
（注：對于細胞壁比較厚的樣品，如藻類食品，可先用石英砂研磨，破壞植物組織細胞。石英砂需進行預處理，將石英砂用20目篩子過篩之后，先用濃鹽酸浸泡，然后再用稀氫氧化銨浸泡，最后用蒸餾水洗至中性后在烘箱中烤干。使用時，每10g樣品加3～5g石英砂于研缽中研磨。）
5.3 洗滌
將上部澄清液倒入已裝有50～100ml 0.14mol/L Na2SO4溶液的分液漏斗中，殘渣再用丙酮提取2～3次，每次用量不少于25ml，上清液并入分液漏斗。殘渣繼續(xù)用石油醚洗滌3～4次，每次用量約25ml，至洗滌液呈無色，將洗滌液倒入同一分液漏斗中，振搖1min，靜置。棄水相，有機相用蒸餾水洗滌4～5遍，至水相澄清。棄水相，將有機相經(jīng)無水Na2SO4脫水后轉(zhuǎn)至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，于60℃水浴中減壓蒸餾至約2ml時取下，立即用氮氣吹干，用石油醚定容至2.0 ml，待凈化。
5.4 裝柱
取干燥色譜柱，將驗證好的氧化鋁浸泡于石油醚中，濕法填充于色譜柱，使氧化鋁自由均勻流下，至柱高為20cm，其上端再加2 cm無水Na2SO4。打開活塞，調(diào)整流速為每秒1滴。一根色譜柱只用于一個樣品測定。
5.5 色譜凈化：待石油醚流至柱上端0.5cm時，加V1 ml樣品提取液，當樣品液流至柱平齊時，加2 ml石油醚沖洗柱壁，流下。再加10ml石油醚洗脫，2次，棄除流出液。然后，用30 ml洗脫液洗脫，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶收集流出液。流出液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮近干，取下用氮氣吹干后，用正己烷定容為V2 ml。將定容液移入小塑料離心管中，5000rpm離心5min，上清液供HPLC分析。
5.6 標準工作曲線的繪制
分別取維生素K1標準應用液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0ml，加入分液漏斗中，按5.2步驟提取，濃縮定容至2.0ml。取1.0ml標準提取液按5.4步驟操作，最后定容至1.0ml，即標準工作曲線中各點維生素K1含量分別相當于5，10，20，40，60，80，100μg/ml。然后再按5.6條件進行HPLC測定，記錄峰面積或峰高。以標準含量為橫坐標，峰面積或峰高為縱坐標繪制標準工作曲線。
5.7 HPLC色譜分析
色譜條件（推薦條件）：
預柱ultrapack ODS，10μm，4.0mm×4.5cm。
分析柱：ultrasphere ODS，C18，5μm，4.6mm×250mm。
流動相：甲醇+正己烷（98+2）�；靹�，臨用前脫氣。
進樣量：20μl。
流速1.5ml/min。
紫外檢測器：波長248nm。量程0.01～0.05。
HPLC穩(wěn)定性的測定：取標準應用液連續(xù)進行6次HPLC測定，計算峰面積或峰高的平均值、標準差和RSD%，如果RSD<1%，說明儀器穩(wěn)定性良好。儀器穩(wěn)定后方可進行樣品測定。
5.8 樣品分析
取樣品凈化液20μl，按色譜條件進行定性、定量分析。
�。�1） 定性：用標準色譜峰的保留時間定性。
�。�2） 定量：用樣品峰面積或峰高在標準工作曲線上查出其相應的維生素K1含量，或用回歸方程求出其含量。
6.計算
（1） 7.1允許差及最小檢出量: 同一實驗室同時或連續(xù)2次測定結(jié)果相對偏差絕對值≤10%，本法最小檢出限為0.5mg。
（2） 本方法避免使用皂化處理，減少了維生素K1的破壞；利用失活的磷酸鹽處理過的氧化鋁進行色譜分離，通過改變洗脫液的極性使維生素K1與雜質(zhì)分離，有利于高效液相色譜對維生素K1的定性及定量分析。
（3） 維生素K1具有很強的親脂性，溶于丙酮、石油醚、正己烷、異辛烷等溶劑中，而不易溶于甲醇、乙醇等溶劑中。當樣品中含有較多的水分時，如直接用石油醚或正己烷提取會使樣品變粘，因此，樣品需先用丙酮提取，或先用無水Na2SO4研磨，然后再用丙酮提取，可起到吸收水分的作用，進一步地破壞樣品的細胞組織，使提取效果更佳。
（4） 以往的報告多選用活性硅膠或中性氧化鋁做色譜柱分離維生素K1，再用極性小的有機溶劑作洗脫液。實際工作中發(fā)現(xiàn)，用硅膠色譜柱，洗脫流速慢，洗脫液用量大，分離時間較長；用未經(jīng)處理的氧化鋁色譜柱分離會出現(xiàn)維生素K1與干擾物分離不清的現(xiàn)象。當氧化鋁用磷酸鹽處理后，氧化鋁的極性增強，使吸附較小的維生素K1易于被洗脫液洗脫出來，而且在處理后的氧化鋁中加入少量水分可以提高柱效，減少維生素K1出峰拖尾的現(xiàn)象，縮短保留了時間，避免了因使用氧化鋁造成的維生素K1可能分解的現(xiàn)象。
（5） 如果氧化鋁色譜柱柱效良好，首先被石油醚洗脫出來的應是胡蘿卜素，且柱上沒有胡蘿卜素黃色帶擴散的現(xiàn)象；葉綠素及其他色素停留在色譜柱的上方?jīng)]有或僅有少量位移但不影響分離效果。
（6） 洗脫液中乙醚含量的多少影響著洗脫液的極性，如果乙醚含量少，可使維生素K1的保留時間延長，反之，會使干擾物質(zhì)被提前洗脫，影響凈化效果。所以應嚴格控制洗脫液中乙醚的比例。
（7） 根據(jù)標準維生素K1紫外掃描圖譜，可見維生素K1于240，248nm，260，269nm波長處有4個特征峰，其中260nm的峰最低。將標準品用HPLC測定，以260nm波長下的峰面積為1，則240nm, 248nm和269nm波長下的峰面積分別為1.15，1.23，1.09。
（8） 一般反相色譜，多用有極性的甲醇作為流動相。在甲醇中加入適量的非極性有機溶劑（如正己烷、異辛烷等），可以增加維生素K1 的溶解能力，有利于縮短保留時間，減少出峰拖尾現(xiàn)象。本方法選擇甲醇+正己烷（98+2）作為流動相，維生素K1的保留時間為15.6±0.1min。
（9） 本方法最小檢測限為0.5μg/ml，在1.0～100.0μg/ml范圍內(nèi)與峰面積有良好的線形關系。批間測定結(jié)果的相對標準偏差在1.3～7.1% （n=6）；回收率為90.9～106.3%。。不同實驗室間測定結(jié)果表明此方法精密度、重現(xiàn)性較好，凈化效果好，試劑價格適中。
一、蔬菜中維生素K1的測定方法-HPLC法
1.原理
蔬菜中的維生素K1經(jīng)有機溶劑提取后，經(jīng)失活的磷酸鹽處理過的氧化鋁色譜柱進行凈化，再用液相色譜法將維生素K1分離并進行定性定量測定。
2.適用范圍
本標準適用于各類蔬菜、綠色植物及其干制品中維生素K1的測定。
3. 儀器：
（1） 實驗室常用設備
（2） 打碎機
（3） 202-R型恒溫干燥箱
（4） 色譜柱：為0.8cm×30cm的玻璃柱，底端收縮變細，并裝有活塞，活塞上約1 cm處有一玻璃篩板，篩板孔徑為16～30μm，柱上端膨大為容積約30ml的儲液池。使用前需干燥
（5） 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器
與旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器配套的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶：具塞，圓底，容積為150ml。
（6） 恒溫水浴鍋
（7） 高純氮氣
（8） 高速離心機
與高速離心機配套的小離心管：具塞，容積為1.5～3.0ml。
（9） 紫外分光光度計
（10） HPLC：高效液相色譜儀，帶紫外檢測器
4.試劑
除特殊說明實驗用水為蒸餾水，試劑為分析純，有機溶劑使用前需重新蒸餾。
3.1 無水硫酸鈉：使用前需在150℃的烘箱內(nèi)烘烤4～8小時，以去除水分。
3.2 0.14mol/L Na2SO4溶液：稱取20g無水硫酸鈉，用蒸餾水溶解后定容至1L。
3.3 丙酮：分析純。
3.4 石油醚：沸程30～60℃，分析純。
3.5 0.6mol/L碘化鉀溶液：稱取10g碘化鉀，用蒸餾水溶解定容至100ml。
3.6 5g/L淀粉液：稱取0.5g可溶性淀粉，用水溶解定容至100ml。
3.7 乙醚：分析純。不含過氧化物。
（1） 過氧化物的檢查方法：用5ml乙醚加1ml0.6mol/L碘化鉀溶液，振搖1min，如有過氧化物則放出游離碘，水層呈黃色�；蚣�4滴5g/L淀粉液，水層呈藍色。則該乙醚含有過氧化物需處理后使用。
（2） 去除過氧化物的方法：重蒸時瓶中加一段純鐵絲，棄去10%初餾液和10%殘留液。
3.8 洗脫液：石油醚+乙醚（97+3）。
3.9 甲醇：優(yōu)級純。
3.10 正己烷：優(yōu)級純。
3.11 磷酸氫二鈉：分析純。
3.12 中性氧化鋁：100～200目。
3.13 氧化鋁的處理：
（1） 磷酸鹽處理氧化鋁：取250g中性氧化鋁，20g磷酸氫二鈉，1.6L蒸餾水，放入容積為2L的錐形瓶中沸水浴30min，不時搖動或攪拌。冷卻，倒掉上層液體（包括懸浮的細小顆粒），然后用布氏漏斗抽濾。將殘留物轉(zhuǎn)至平底玻璃皿中，于150℃干燥箱中烘烤3～5h至兩次稱量相差3g以下，烘烤過程中不時攪拌，以避免結(jié)塊，冷卻后放入干燥器中保存。
（2） 失活處理氧化鋁：使用前，將磷酸鹽處理的氧化鋁，加入具塞錐形瓶中。每100g氧化鋁加9.0ml去離子水，蓋緊瓶塞，蒸汽浴或80℃干燥箱加熱3～5min，劇烈搖動錐形瓶，使氧化鋁可以自由流動，無結(jié)塊。冷卻，靜置30分鐘，使水分分布均勻。
（3） 驗證處理過的氧化鋁：取標準應用液1.0ml，用氮氣吹干，再用石油醚溶解定容至1.0ml。然后按5.3裝柱，將標準溶液加入柱上，按5.4凈化步驟進行柱色譜，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶收集洗脫流出液，濃縮，氮氣吹干，用正己烷定容至1.0ml，HPLC測定，記錄峰面積或峰高（A）。另取標準應用液直接測定，記錄峰面積或峰高（Ar）。將A與Ar進行比較，其值在0.97～1.03之間（A/Ar），則說明柱效較好，氧化鋁處理合格。否則需重新進行失活處理。如果再次驗證比值仍不能達到0.97，則需重新制備氧化鋁。
3.14 維生素K1標準：Sigma公司，純度>98%。
3.15 標準貯備液：精確稱取50.0mg維生素K1標準，用正己烷溶解定容至50.0ml，即1.0mg/ml。將儲備液分裝成安瓿，冷凍保存。
3.16 標準工作液：取標準貯備液， 用正己烷準確稀釋50倍, 即20.0μg/ml。
標準工作液的標定：取標準應用液測定紫外吸光值，波長248nm，比色杯厚度1cm，以正己烷為空白，測定3次，取平均值，按下式計算標準應用液濃度。
|
X1 = |
A |
×M ×103 |
……………………………………(1) |
|
E |
式中：
X1 -- 維生素K1標準應用液濃度，μg/ml；
A -- 標準應用液平均紫外吸光值；
E -- 摩爾消光系數(shù)，20,000；
M -- 維生素K1分子量450.7；
103 -- 換算成μg/ml的換算系數(shù)。
A -- 標準應用液平均紫外吸光值；
E -- 摩爾消光系數(shù)，20,000；
M -- 維生素K1分子量450.7；
103 -- 換算成μg/ml的換算系數(shù)。
5.操作步驟
所有操作均需避光進行
5.1 樣品處理
（1） 新鮮蔬菜：揀凈去雜物，將可食部洗凈，擦去表面水分，切碎，用打碎機制備成勻漿。
（2） 干制植物性樣品：磨碎,過60目篩。
5.2 樣品提取
（1） 稱取已打成勻漿的新鮮樣品2～10g（維生素K1含量不低于2μg），加到具塞錐形瓶中,再加入5～10倍體積的丙酮,蓋上塞子,振搖3～5min，靜置1min，以下按5.3步驟操作。
（2） 稱取干制植物性樣品0.2～4g（維生素K1含量不低于2μg）,加到研缽中，再加入2～4倍于樣品量的無水Na2SO4研磨均勻后,加入25ml丙酮,研磨3～5min，靜置1min。
（注：對于細胞壁比較厚的樣品，如藻類食品，可先用石英砂研磨，破壞植物組織細胞。石英砂需進行預處理，將石英砂用20目篩子過篩之后，先用濃鹽酸浸泡，然后再用稀氫氧化銨浸泡，最后用蒸餾水洗至中性后在烘箱中烤干。使用時，每10g樣品加3～5g石英砂于研缽中研磨。）
5.3 洗滌
將上部澄清液倒入已裝有50～100ml 0.14mol/L Na2SO4溶液的分液漏斗中，殘渣再用丙酮提取2～3次，每次用量不少于25ml，上清液并入分液漏斗。殘渣繼續(xù)用石油醚洗滌3～4次，每次用量約25ml，至洗滌液呈無色，將洗滌液倒入同一分液漏斗中，振搖1min，靜置。棄水相，有機相用蒸餾水洗滌4～5遍，至水相澄清。棄水相，將有機相經(jīng)無水Na2SO4脫水后轉(zhuǎn)至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，于60℃水浴中減壓蒸餾至約2ml時取下，立即用氮氣吹干，用石油醚定容至2.0 ml，待凈化。
5.4 裝柱
取干燥色譜柱，將驗證好的氧化鋁浸泡于石油醚中，濕法填充于色譜柱，使氧化鋁自由均勻流下，至柱高為20cm，其上端再加2 cm無水Na2SO4。打開活塞，調(diào)整流速為每秒1滴。一根色譜柱只用于一個樣品測定。
5.5 色譜凈化：待石油醚流至柱上端0.5cm時，加V1 ml樣品提取液，當樣品液流至柱平齊時，加2 ml石油醚沖洗柱壁，流下。再加10ml石油醚洗脫，2次，棄除流出液。然后，用30 ml洗脫液洗脫，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶收集流出液。流出液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮近干，取下用氮氣吹干后，用正己烷定容為V2 ml。將定容液移入小塑料離心管中，5000rpm離心5min，上清液供HPLC分析。
5.6 標準工作曲線的繪制
分別取維生素K1標準應用液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0ml，加入分液漏斗中，按5.2步驟提取，濃縮定容至2.0ml。取1.0ml標準提取液按5.4步驟操作，最后定容至1.0ml，即標準工作曲線中各點維生素K1含量分別相當于5，10，20，40，60，80，100μg/ml。然后再按5.6條件進行HPLC測定，記錄峰面積或峰高。以標準含量為橫坐標，峰面積或峰高為縱坐標繪制標準工作曲線。
5.7 HPLC色譜分析
色譜條件（推薦條件）：
預柱ultrapack ODS，10μm，4.0mm×4.5cm。
分析柱：ultrasphere ODS，C18，5μm，4.6mm×250mm。
流動相：甲醇+正己烷（98+2）�；靹�，臨用前脫氣。
進樣量：20μl。
流速1.5ml/min。
紫外檢測器：波長248nm。量程0.01～0.05。
HPLC穩(wěn)定性的測定：取標準應用液連續(xù)進行6次HPLC測定，計算峰面積或峰高的平均值、標準差和RSD%，如果RSD<1%，說明儀器穩(wěn)定性良好。儀器穩(wěn)定后方可進行樣品測定。
5.8 樣品分析
取樣品凈化液20μl，按色譜條件進行定性、定量分析。
�。�1） 定性：用標準色譜峰的保留時間定性。
�。�2） 定量：用樣品峰面積或峰高在標準工作曲線上查出其相應的維生素K1含量，或用回歸方程求出其含量。
6.計算
| X2= | c×2×V2 ×100 | ………………………（2） |
|
V1×m |
式中： X2 -- 樣品中維生素K1的含量,μg/100g;
c -- 由標準工作曲線上查出或回歸方程求出的維生素K1含量,μg;
2 -- 樣品提取后的定容體積,ml;
V1 -- 樣品凈化處理時的取液量,ml;
V2 -- 樣品凈化后的定容體積,ml;
m -- 樣品質(zhì)量,g。
c -- 由標準工作曲線上查出或回歸方程求出的維生素K1含量,μg;
2 -- 樣品提取后的定容體積,ml;
V1 -- 樣品凈化處理時的取液量,ml;
V2 -- 樣品凈化后的定容體積,ml;
m -- 樣品質(zhì)量,g。
7. 注意事項
（1） 7.1允許差及最小檢出量: 同一實驗室同時或連續(xù)2次測定結(jié)果相對偏差絕對值≤10%，本法最小檢出限為0.5mg。
（2） 本方法避免使用皂化處理，減少了維生素K1的破壞；利用失活的磷酸鹽處理過的氧化鋁進行色譜分離，通過改變洗脫液的極性使維生素K1與雜質(zhì)分離，有利于高效液相色譜對維生素K1的定性及定量分析。
（3） 維生素K1具有很強的親脂性，溶于丙酮、石油醚、正己烷、異辛烷等溶劑中，而不易溶于甲醇、乙醇等溶劑中。當樣品中含有較多的水分時，如直接用石油醚或正己烷提取會使樣品變粘，因此，樣品需先用丙酮提取，或先用無水Na2SO4研磨，然后再用丙酮提取，可起到吸收水分的作用，進一步地破壞樣品的細胞組織，使提取效果更佳。
（4） 以往的報告多選用活性硅膠或中性氧化鋁做色譜柱分離維生素K1，再用極性小的有機溶劑作洗脫液。實際工作中發(fā)現(xiàn)，用硅膠色譜柱，洗脫流速慢，洗脫液用量大，分離時間較長；用未經(jīng)處理的氧化鋁色譜柱分離會出現(xiàn)維生素K1與干擾物分離不清的現(xiàn)象。當氧化鋁用磷酸鹽處理后，氧化鋁的極性增強，使吸附較小的維生素K1易于被洗脫液洗脫出來，而且在處理后的氧化鋁中加入少量水分可以提高柱效，減少維生素K1出峰拖尾的現(xiàn)象，縮短保留了時間，避免了因使用氧化鋁造成的維生素K1可能分解的現(xiàn)象。
（5） 如果氧化鋁色譜柱柱效良好，首先被石油醚洗脫出來的應是胡蘿卜素，且柱上沒有胡蘿卜素黃色帶擴散的現(xiàn)象；葉綠素及其他色素停留在色譜柱的上方?jīng)]有或僅有少量位移但不影響分離效果。
（6） 洗脫液中乙醚含量的多少影響著洗脫液的極性，如果乙醚含量少，可使維生素K1的保留時間延長，反之，會使干擾物質(zhì)被提前洗脫，影響凈化效果。所以應嚴格控制洗脫液中乙醚的比例。
（7） 根據(jù)標準維生素K1紫外掃描圖譜，可見維生素K1于240，248nm，260，269nm波長處有4個特征峰，其中260nm的峰最低。將標準品用HPLC測定，以260nm波長下的峰面積為1，則240nm, 248nm和269nm波長下的峰面積分別為1.15，1.23，1.09。
（8） 一般反相色譜，多用有極性的甲醇作為流動相。在甲醇中加入適量的非極性有機溶劑（如正己烷、異辛烷等），可以增加維生素K1 的溶解能力，有利于縮短保留時間，減少出峰拖尾現(xiàn)象。本方法選擇甲醇+正己烷（98+2）作為流動相，維生素K1的保留時間為15.6±0.1min。
（9） 本方法最小檢測限為0.5μg/ml，在1.0～100.0μg/ml范圍內(nèi)與峰面積有良好的線形關系。批間測定結(jié)果的相對標準偏差在1.3～7.1% （n=6）；回收率為90.9～106.3%。。不同實驗室間測定結(jié)果表明此方法精密度、重現(xiàn)性較好，凈化效果好，試劑價格適中。