霉菌在食品加工工業(yè)中用途十分廣泛，許多釀造發(fā)酵食品、食品原料的制造，如豆腐乳、豆豉、醬、醬油、檸檬酸等都是在霉菌的參與下生產(chǎn)加工出來的。絕大多數(shù)霉菌能把加工所用原料中的淀粉、糖類等碳水化合物、蛋白質(zhì)等含氮化合物及其它種類的化合物進行轉(zhuǎn)化，制造出多種多樣的食品、調(diào)味品及食品添加劑。不過，在許多食品制造中，除了利用霉菌以外，還要有細菌、酵母的共同作用下來完成。在食品釀造業(yè)中，常常以淀粉質(zhì)為主要原料。只有將淀粉轉(zhuǎn)化為糖才能被酵母菌及細菌利用。
3.1 生產(chǎn)用霉菌菌種
淀粉的糖化、蛋白質(zhì)的水解均是通過霉菌產(chǎn)生的淀粉酶和蛋白質(zhì)水解酶進行的。通常情況是先進行霉菌培養(yǎng)制曲。淀粉、蛋白質(zhì)原料經(jīng)過蒸煮糊化加入種曲，在一定溫度下培養(yǎng)，曲中由霉菌產(chǎn)生的各種酶起作用，將淀粉、蛋白質(zhì)分解成糖、氨基酸等水解產(chǎn)物。
在生產(chǎn)中利用霉菌作為糖化菌種很多。根霉屬中常用的有日本根霉(Rhizopus japonicus AS3. 849)、米根霉(Rhizopus oryzae)、華根霉(Rhizopus chinensis〉等；曲霉屬中常用的有黑曲霉(Aspergillus niger)、宇佐美曲霉(Asp. usamii)、米曲霉(Asp. oryzae)和泡盛曲霉(Asp. awamori)等；毛霉屬中常用的有魯氏毛霉(Mucor rouxii)，還有紅曲屬(Monascus)中的一些種也是較好的糖化劑，如紫紅曲霉(Monascus. Purpurens)、安氏紅曲霉(Monascus. anka)、銹色紅曲霉(Monascus. rubiginosusr)、變紅曲霉(Monascus. serorubescons AS3.976)等。
3.2 醬類
醬類包括大豆醬、蠶豆醬、面醬、豆瓣醬、豆豉及其加工制品，都是由一些糧食和油料作物為主要原料，利用以米曲霉為主的微生物經(jīng)發(fā)酵釀制的。醬類發(fā)酵制品營養(yǎng)豐富，易于消化吸收，即可作小菜，又是調(diào)味品，具有特有的色、香、味，價格便宜，是一種受歡迎的大眾化調(diào)味品。
用于醬類生產(chǎn)的霉菌主要是米曲霉（Asp.oryzae），生產(chǎn)上常用的有滬釀3.042，黃曲霉Cr-1菌株（不產(chǎn)生毒素），黑曲霉（Asp. Nigerf-27）等。所用的曲霉具有較強的蛋白酶、淀粉酶及纖維素酶的活力，它們把原料中的蛋白質(zhì)分解為氨基酸，淀粉變?yōu)樘穷�，在其他微生物的共同作用下生成醇、酸、酯等，形成醬類特有的風味。
市場上的豆醬種類繁多，其生產(chǎn)釀造工藝也不盡相同，生產(chǎn)用原輔料差異很大。下面是大豆醬的生產(chǎn)工藝。
3.2.1 制曲工藝
1) 制曲工藝流程
水 水 面粉 種曲
↓ ↓ ↓ ↓
大豆→洗凈→浸泡→蒸煮→冷卻→混合→接種→厚層通風培養(yǎng)→大豆曲
2) 制曲原料的處理
大豆洗凈、浸泡及蒸熟；面粉在過去采用炒焙方法，現(xiàn)在有些廠家直接利用生面粉而不預(yù)以處理。
3) 制曲操作
制曲時原料配比為大豆100kg，標準粉40~60kg。種曲用量為0.15%~0.3%，種曲使用時先與面粉拌和。為了使豆醬中麩皮含量減少，種曲最好用分離出的孢子（曲精）；由于豆粒較大，水分不易散發(fā)，制曲時間適當延長。
4) 制醬
①工藝流程
配制→澄清→鹽水加熱————————————∣
↓ ↓
大豆曲→發(fā)酵容器→自然升溫→加第一次鹽水→醬醅保溫發(fā)酵→加第二次鹽水及鹽→翻醬→成品
② 制醬工藝
先將大豆曲倒入發(fā)酵容器內(nèi)，表面扒平，稍予壓實，很快會自然升溫至40℃左右。在將準備好的14.5oB′熱鹽水（加熱至60~65℃）加至面層，讓它逐漸全部滲入曲內(nèi)。最后面層加封面用細鹽一層，并將蓋蓋好。大豆曲加入熱鹽水后，醅溫即能達到45℃左右，以后維持此溫度10d，醬醅就成熟。發(fā)酵完畢，補加240Be′鹽水及所需細鹽（包括封面鹽），壓縮空氣或翻醬機充分攪拌，務(wù)使所加的細鹽全部溶化，同時混合均勻，在室溫中后發(fā)酵即的成品。
3.3 醬油
醬油是人們常用的一種食品調(diào)味料，營養(yǎng)豐富，味道鮮美，在我國已有兩千多年的歷史。它是用蛋白質(zhì)原料(如豆餅、豆柏等)和淀粉質(zhì)原料(如麩皮、面粉、小麥等)，利用曲霉及其他微生物的共同發(fā)酵作用釀制而成的。
醬油生產(chǎn)中常用的霉菌有米曲霉、黃曲霉和黑曲霉等，應(yīng)用于醬油生產(chǎn)的曲霉菌株應(yīng)符合如下條件：不產(chǎn)黃曲霉毒素；蛋白酶、淀粉酶活力高，有谷氨酰胺酶活力；生長快速、培養(yǎng)條件粗放、抗雜菌能力強；不產(chǎn)生異味，制曲釀造的醬制品風味好。
3.3.1 醬油生產(chǎn)霉菌
醬油生產(chǎn)所用的霉菌主要是米曲霉(Asp. Oryzae)。生產(chǎn)上常用的米曲霉菌株有：AS 3.951(滬釀3.042)；UE328、UE336；AS 3.863；渝3.811等。
生產(chǎn)中常常是由兩菌種以上復(fù)合使用，以提高原料蛋白質(zhì)及碳水化合物的利用率，提高成品中還原糖、氨基酸、色素以及香味物質(zhì)的水平。除曲霉外，還有酵母菌、乳酸菌參與發(fā)酵，它們對醬油香味的形成也起著十分重要的作用。
3.3.2 種曲原料及其配比
目前一般采用的幾種配比：
麩皮80kg、面粉（或甘薯干粉）20kg、水70kg左右； 麩皮85kg、面粉85kg、水90kg、麩皮100kg、水95~100kg；
3.3.3 原料處理
先將麩皮與輔料用拌和機拌勻，再加水充分拌和。由于一次加水蒸煮后熟料粘度高，團快多，過篩困難，應(yīng)采用兩次潤水方法。即在混合原料中先加40%~50%的水，蒸熟過篩后再補充清潔的冷開水30%~45%。為防止雜菌的污染，可在冷開水中添加按總原料計0.3%的食用級冰醋酸或0.5~1%的醋酸鈉拌勻。蒸料時先開起蒸汽，排盡冷水，分層進料。注意原料必須灑于冒蒸氣處，灑料要求松散，切忌將原料壓實而堵塞蒸氣，導(dǎo)致蒸料不勻。進料完畢、全面冒汽后加蓋蒸煮。常壓蒸煮冒汽后維持1h，燜30min，或采用加壓蒸煮0.1Mpa維持30min出鍋，然后過篩，移入拌和臺上攤開，適當翻拌，使之快速冷卻。
3.3.4 種曲制備
1) 工藝流程
一級種→二級種→三級種
↓
麩皮、面粉→加水混合→蒸料→過篩→冷卻→接種→裝匾→曲室培養(yǎng)→種曲
2) 試管斜面菌種培養(yǎng)
① 培養(yǎng)基
5°Be′豆餅汁100ml，MgSO4 0.05g，NaH2PO4 0.1g，可溶性淀粉2.0g，瓊脂1.5g，0.1MPa蒸汽滅菌30min，制成斜面試管。
② 培養(yǎng)
將菌種接入斜面，置30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，待長出茂盛的黃綠色孢子，并無雜菌，即可作為三角瓶菌種擴大培養(yǎng)。
3) 三角瓶純菌種擴大培養(yǎng)
① 培養(yǎng)基
麩皮80g，面粉20g，水80-90ml或麩皮85g，豆餅粉15g，水95ml。原料混合均勻分裝入帶棉塞的三角瓶中，瓶中料厚度1cm左右，在0.1MPa蒸汽壓力下滅菌30min，滅菌后趁熱搖松曲料。
② 培養(yǎng)
曲料冷卻后接入試管斜面菌種，搖勻，置30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18h左右，當瓶內(nèi)曲料已發(fā)白結(jié)餅，搖瓶一次，將結(jié)塊搖碎，繼續(xù)培養(yǎng)4h，再搖瓶一次，經(jīng)過2d培養(yǎng)，把三角瓶倒置，以促進底部曲霉生長，繼續(xù)培養(yǎng)1d，待全部長滿黃綠色的孢子即可使用。若放置較長時間，應(yīng)陰涼處或冰箱中。
4) 種曲培養(yǎng)
① 曲料配比
目前一般采用的配比有兩種： 麩皮80kg，面粉20kg，水70kg左右；麩皮100kg，水95~100kg。加水量應(yīng)視原料的性質(zhì)而定。根據(jù)經(jīng)驗，使拌料后的原料能捏成團，觸之即碎為宜。原料拌勻后過3.5目篩。堆積潤水1h，0.1MPa蒸汽壓下蒸料30min，或常壓蒸料1h再燜30min 。要求熟料疏松，含水量50%~54%。
② 培養(yǎng)
待曲料品溫降至40℃左右即可接種，將三角瓶的種曲散布于曲料中，翻拌均勻，使米曲霉孢子與曲料充分混勻，接種量一般為0.5%~1%。制種曲的兩種常用方法：
a 竹匾培養(yǎng)
接種完畢，曲料移入竹匾內(nèi)攤平，厚度約2cm，種曲室溫度控制在28~30℃，培養(yǎng)16h左右，當曲料上出現(xiàn)白色菌絲，品溫升高到38℃左右時可進行翻曲。翻曲前調(diào)換曲室的空氣，將曲塊用手捏碎，用噴霧器補加40℃左右的無菌水，補加水量40%左右，噴水完畢，再過篩1次，使水分均勻。然后分匾攤平，厚度1cm，上蓋溫紗布，以保持足夠的溫度。翻曲后，種曲室溫控制在26~28℃之間，4~6h后，可見面上菌絲生長，這一階段必須注意品溫，隨時調(diào)整竹匾上下位置及室溫，務(wù)使品溫不超過38℃，并經(jīng)常保持紗布潮濕，這是制好種曲的關(guān)鍵。若品溫過高，會影響發(fā)芽率。再經(jīng)過10h左右，曲料呈淡黃綠色，品溫下降至32~35℃。在室溫28~30℃下，繼續(xù)培養(yǎng)35h左右，曲料上長滿孢子，此時可以揭去紗布，開窗放出室內(nèi)濕氣，并控制室溫略高于30℃，以促進孢子完全成熟。整個培養(yǎng)時間需68-72h。
b 曲盤培養(yǎng)
接種完畢，曲料裝入曲盤內(nèi)，將曲盤柱形堆疊于曲室內(nèi)，室溫28~30℃，培養(yǎng)16h左右。當曲面面層稍有發(fā)白、結(jié)塊，品溫達到40℃時，進行第一次翻曲。翻曲后，曲盤改為品字形堆疊，控制品溫28~30℃，4~6h后品溫上升到36℃，即進行第二次翻曲。每翻畢一盤，盤上蓋滅菌的草簾一張，控制品溫36℃，再培養(yǎng)30h后揭去草簾，繼續(xù)培養(yǎng)24h左右，種曲成熟。
3.3.5 成曲生產(chǎn)
1) 工藝流程
種曲
↓
原料→粉碎→潤水→蒸料→冷卻→接種→通風培養(yǎng)→成曲
2) 發(fā)酵
① 原料的選擇和配比
醬油生產(chǎn)中是以釀制醬油的全部蛋白質(zhì)原料和淀粉質(zhì)原料制曲后，再經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)醬油的。所以制曲原料的選用，即要滿足米曲霉正常生長繁殖和產(chǎn)酶，又要考慮到醬油本身質(zhì)量的需要。脫脂大豆的蛋白質(zhì)含量非常豐富，宜作原料；麩皮質(zhì)地疏松，適合于米曲霉的生長和產(chǎn)酶，因此，可以作輔料。制曲的配比生產(chǎn)廠家不進相同。醬油的鮮味主要來源于原料中的蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物氨基酸，而醬油的香甜則來源于原料中淀粉分解產(chǎn)物糖及發(fā)酵生成的醇、酯等物質(zhì)，所以，若需釀制香甜味濃厚、體態(tài)粘稠的醬油，則在配比中要適當增加淀粉質(zhì)原料。使用豆粕（豆餅）和麩皮為原料，常用的配比是：8：2、7：3、6：4和5：5。
② 制曲原料的處理
a 原料粉碎及潤水
豆餅粉碎使其有適當?shù)牧６龋阌跐櫵驼糁�。一般若原料顆粒小，則表面積大，米曲霉生長繁殖面積大，原料利用率高。粉碎后的豆餅與麩皮按一定的比例充分的拌勻后，即可進行潤水。所謂潤水，就是給原料加上適當?shù)乃�，并使原料均勻而完全地吸收水分的工藝。其目的在于使原料吸收一定量水分后膨脹、松軟，在蒸煮時蛋白質(zhì)容易達到適度的變性；淀粉充分的糊化；溶出曲霉生長所需的營養(yǎng)成分，也為曲霉生長提供了所需的水分。
b 原料蒸料
使原料中蛋白質(zhì)達到適度變性，成為酶易作用的狀態(tài)。使原料中的淀粉充分糊化，以利于糖化；殺滅原料中的雜菌，減少制曲時的污染；要蒸料均勻并掌握蒸料的最適程度，達到原料蛋白質(zhì)的適度變性；防止蒸料不透或不均勻而存在未變性的蛋白質(zhì)，或蒸煮過度而過度變性使蛋白質(zhì)發(fā)生褐變現(xiàn)象。蒸料的設(shè)備目前國內(nèi)蒸煮設(shè)備有三種類型，即常壓蒸煮鍋、加壓蒸煮鍋和連續(xù)管道蒸煮設(shè)備。目前國內(nèi)醬油廠大多使用旋轉(zhuǎn)式加壓蒸煮鍋。
③ 厚層通風制曲
就是將曲料置于曲池（也稱曲箱）內(nèi)，其厚度增至30cm左右，利于通風機供給空氣及調(diào)節(jié)溫度，促使半曲霉迅速生長繁殖。
a 制曲時原料的物理變化
曲霉在曲料上生長的變化：曲料制種進入曲箱后，米曲霉得到適當?shù)臏囟群退�，開始發(fā)芽生長。曲霉的最適發(fā)芽溫度為30~32℃。通風制曲開始時的堆積，品溫以維持32℃左右為宜。在最初的4~5d是米曲霉的孢子發(fā)芽階段，所以成為孢子發(fā)芽期。
b 制曲時霉菌的生物學變化
孢子發(fā)芽后，接著生長菌絲。當靜止培養(yǎng)8h左右時，品溫已逐漸上升到36℃，需要進行間歇或連續(xù)通風，一方面調(diào)節(jié)品溫，另一方面換新鮮空氣，以利米曲霉生長。繼續(xù)維持品溫在35℃左右，培養(yǎng)12h左右，當肉眼稍見曲料發(fā)白時進行第一次翻曲，稱為菌絲生長期。
④ 固態(tài)低鹽發(fā)酵
在醬油發(fā)酵過程中，根據(jù)醪醅的狀態(tài)，有稀醪發(fā)酵、固態(tài)發(fā)酵及固稀發(fā)酵之分；根據(jù)加鹽量的多少，可分為高鹽發(fā)酵、低鹽發(fā)酵和無鹽發(fā)酵三種；根據(jù)加溫狀況不同，又可分為曬夜露與保溫速釀兩類。
a 工藝流程
成曲→打碎→加鹽水拌合(在12~13°Be′，55℃左右的鹽水，含水量50%~55%等條件下)→保溫發(fā)酵(50~55℃，4~6d)→成熟醬醅
b 固態(tài)低鹽發(fā)酵工藝
a) 食鹽水的配制
食鹽溶解后，以波美計測定其濃度，并根據(jù)當時溫度調(diào)整到規(guī)定的濃度。一般經(jīng)驗是100kg水加鹽1.5kg左右得鹽水10°Be′，但往往因食鹽質(zhì)量不同及溫度不同而需要增減用鹽量。采用波美計檢定鹽水濃度二般是以20℃為標準溫度，而實際生產(chǎn)上配制鹽水時，往往高于或低于此溫度，因此，必須換算成標準溫度。
b) 發(fā)酵料的配制
先將已準備好的糖漿鹽水加熱到50~55℃(根據(jù)下池后發(fā)酵品溫的要求，掌握糖漿鹽水溫度的高低)，再將成曲通過制醅機的碎曲齒，由升高機的提升斗，輸入螺旋拌和器中與糖漿鹽水一起拌和均勻，落人發(fā)酵池內(nèi)。初開始時，池底15cm左右的成曲拌糖漿鹽水略少，以后用閥門掌握成曲與糖漿鹽水的流速數(shù)量，使拌曲完畢后，多出150kg左右的糖漿鹽水，將此糖漿鹽水澆于料面。待糖漿鹽水全部吸人料內(nèi)，最后面層加蓋聚乙烯薄膜，四周加鹽將膜壓緊，并在指定的點上插入溫度計，池面加蓋。
如果不用酶法生產(chǎn)，即將淀粉質(zhì)原料與豆餅一起混合，經(jīng)過潤水、蒸煮及制曲后，直接加入12~180°Be′熱鹽水(55℃左右)，
c) 保溫發(fā)酵及管理
保溫發(fā)酵時溫度與時間的掌握，各廠根據(jù)設(shè)備情況及要求的不同而各異。發(fā)酵時，成曲與糖漿鹽水拌和人池后，醬醅品溫要求在42~46℃之間，保持4d，在此期間，品溫基本穩(wěn)定，夏天不需要開蒸氣保溫，冬天如醋溫不足需要進行保溫。從第5d起按每天開汽3次的辦法使品溫逐步上升，最后提高到48~50℃。低鹽發(fā)哮的時間一般為10d，醬醅已基本上成熟。但為了增加風味，往往延長發(fā)酵期12~15d，發(fā)酵溫度前期為42~44℃，中間為44~46℃，后期為46~48℃。有的廠還采用淋澆發(fā)酵的辦法，醬醅面上不封鹽，制醅后相隔2~3h將醬汁(曲液水)先回澆一次于醬醅內(nèi)，使酶和水分較為均勻。發(fā)酵溫度5d天內(nèi)為40~45℃，5天后逐步提高品溫至45~48℃。前4d每天淋澆兩次，4d后每天淋澆一次。發(fā)酵期共為10d。淋澆對發(fā)酵是有好處的，使發(fā)酵溫度均勻，醬汁中的酶充分利用，并且可以減少面層的氧化層，因而能提高醬油的風味。它的缺點是需要增加淋澆設(shè)備與淋澆操作，在工藝上帶來不方便。
固態(tài)低鹽發(fā)酵期間要有專人負責，按時測定醬醋溫度，做好記錄。冬天要防止四周及面層的醬醋溫度過低。如發(fā)現(xiàn)不正常狀況，必須及時采取適當?shù)拇胧?
⑤ 浸出提油及成品配制
a 工藝流程
二油 三油 水
↓ ↓ ↓
加熱 加熱 加熱
↓ ↓ ↓
成熟醬醅→第一次浸泡→頭渣→第二次浸泡→二渣→第三次浸泡→殘渣
↓ ↓ ↓
第一濾油 第二濾油 第三濾油
↓ ↓ ↓
頭油 二油 三油
b 成品配制
以上提取的頭油和二油并不是成品，必須按統(tǒng)一的質(zhì)量標準或不同的食用用途進行配兌，調(diào)配好的醬油還須經(jīng)滅菌、包裝，并經(jīng)檢驗合格后才能出廠。
3.4 檸檬酸
檸檬酸(Citric acid)分子式為C6H807。又名枸櫞酸，外觀為白色顆粒狀或白色結(jié)晶粉末，無臭，具有另人愉快的強烈的酸味，相對密度為1.6550。檸檬酸易溶于水、酒精、不溶于醚、酯、氯仿等有機溶劑。商品檸檬酸主要是無水檸檬酸和一水檸檬酸，前者在高于36.6℃的水溶液中結(jié)晶析出，后者在低于36.6℃水溶液中結(jié)晶析出。它天然存在于果實中，其中以柑桔、菠蘿、檸檬、無花果等含量較高。檸檬酸是生物體主要代謝產(chǎn)物之一。早期的檸檬酸生產(chǎn)是以檸檬、柑桔等天然果實為原料加工而成的。1893年德國微生物學家Wehmen發(fā)現(xiàn)二種青霉菌能夠積累檸檬酸，1923年美國科學家研究成功了以廢糖蜜為原料的淺盤法檸檬酸發(fā)酵，并設(shè)廠生產(chǎn)。1951年美國Miles公司首先采用深層發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)檸檬酸。我國1968年用薯干為原料采用深層發(fā)酵法生產(chǎn)檸檬酸成功，由于工藝簡單、原料豐富、發(fā)酵水平高，各地陸續(xù)辦廠投產(chǎn)，至20世紀70年代中期，檸檬酸工業(yè)已初步形成了生產(chǎn)體系。
3.4.1 檸檬酸在食品中的應(yīng)用
1) 飲料與冰淇淋
檸檬酸廣泛用于配制各種水果型的飲料以及軟飲料。檸檬酸本身是果汁的天然成分之一，不僅賦于飲料水果風味，而且具有增溶、緩沖、抗氧化等作用，能使飲料中的糖、香精、色素等成分交融協(xié)調(diào)，形成適宜的口味和風味；添加檸檬酸可以改善冰淇淋的口味，增加乳化穩(wěn)定性，防止氧化作用。
2) 果醬與釀造酒
檸檬酸在果醬與果凍中同樣可以增進風味，并使產(chǎn)品抗氧化作用。由于果醬、果凍的凝膠性質(zhì)需要一定范圍的pH值，添加一定量的檸檬酸可以滿足這一要求。
當葡萄或其它釀酒原料成熟過度而酸度不足時，可以用檸檬酸調(diào)節(jié)，以防止所釀造的酒口味單薄。檸檬酸加到這些果汁中還有抗氧化和保護色素的作用，以保護果汁的新鮮感和防止變色。
3) 腌制品
各種肉類和蔬菜在腌制加工時，加入或涂上檸檬酸可以改善風味，除腥去臭，抗氧化。
4) 罐頭食品
加入檸檬酸除了調(diào)酸作用之外，還有螯合金屬離子的作用，保護其中的抗壞血酸，使之不被金屬離子破壞。檸檬酸添加到植物油中也有類似的作用。
5) 豆制品及調(diào)味品
用含有檸檬酸的水浸漬大豆，可以脫腥并便于后續(xù)加工。檸檬酸可以用于大豆等豆類蛋白、葵花子蛋白的水解，生產(chǎn)出風味別致的調(diào)味品。它也可以用于成熟調(diào)味品（醬油等）的調(diào)味。
6) 其它
檸檬酸在醫(yī)藥、化學等其它工業(yè)中也有一定的作用。檸檬酸鐵胺可以用作補血劑；檸檬酸鈉可用作輸血劑；檸檬酸可制造食品包裝用薄膜及無公害洗滌劑。
3.4.2 檸檬酸發(fā)酵微生物
1) 黑曲霉（Aspergillus niger）的形態(tài)特征
目前生產(chǎn)上常用產(chǎn)酸能力強的黑曲霉作為生產(chǎn)菌。在固體培養(yǎng)基上，菌落由白色逐漸變至棕色。孢子區(qū)域為黑色，菌落呈絨毛狀，邊緣不整齊。菌絲有隔膜和分枝，是多細胞的菌絲體，無色或有色，有足細胞，頂囊生成一層或兩層小梗，小梗頂端產(chǎn)生一串串分生孢子。
2) 黑曲霉（Aspergillus niger）的生理特征
黑曲霉生產(chǎn)菌可在薯干粉、玉米粉、可溶性淀粉糖蜜、葡萄糖麥芽糖、糊精、乳糖等培養(yǎng)基上生長、產(chǎn)酸。黑曲霉生長最適pH值因菌種而異，一般為pH3~7；產(chǎn)酸最適pH為1.8~2.5。生長最適溫度為33~37℃，產(chǎn)酸最適溫度在28~37℃，溫度過高易形成雜酸，斜面培養(yǎng)要求在麥芽汁40Be′左右的培養(yǎng)基上。黑曲霉以無性生殖的形式繁殖，具有多種活力較強的酶系，能力用淀粉類物質(zhì)，并且對蛋白質(zhì)、單寧、纖維素、果膠等具有一定的分解能力。黑曲霉可以邊長菌、邊糖化、邊發(fā)酵產(chǎn)酸的方式生產(chǎn)檸檬酸。
3.4.3 檸檬酸發(fā)酵機理
關(guān)于檸檬酸發(fā)酵的機制雖有多種理論，但目前大多數(shù)學者認為它與三羧酸循環(huán)有密切的關(guān)系。糖經(jīng)糖酵解途徑(EMP途徑)，形成丙酮酸，丙酮酸羧化形成C4化合物，丙酮酸脫羧形成C2化合物，兩者縮合形成檸檬酸（見發(fā)酵代謝）。
3.4.4 檸檬酸發(fā)酵用原料
檸檬酸發(fā)酵的原料有糖質(zhì)原料(甘煎廢糖蜜、甜菜廢糖蜜)、淀粉質(zhì)原料(主要是番薯、馬鈴薯、木薯等)和正烷烴類原料三大類。
3.4.5 檸檬酸發(fā)酵工藝
1) 試管斜面菌種培養(yǎng)
察氏瓊脂培養(yǎng)基：NaNO3 3g， 蔗糖20g， K2HPO4 1g， KCl 0.5g， MgSO4.7 H2O 0.5g， FeSO4 0.01g， 瓊脂20g， 用水定溶至1000ml， pH自然。
察氏-多氏瓊脂培養(yǎng)基：蔗糖30g，NaNO3 2g， MgSO4.7H2O 0.5g， KH2PO4 1g， KCl 0.5g， FeSO4.7H2O 0.01g， 溴甲分綠0.4g，瓊脂20g， 蒸餾水1000ml， pH自然。
蔗糖合成瓊脂培養(yǎng)基：蔗糖140g， NH4NO3 2g， KH2PO4 2g， MgO4.7H2O 0.25g， FeCl3.6H2O 0.02g， MnSO4.4H2O 0.02g， 麥芽汁20ml， 瓊脂20g， 用水定溶至1000ml。
米曲汁瓊脂培養(yǎng)基：一份米曲加四倍質(zhì)量的水，于55℃保溫糖化3~4小時后煮沸，濾液用水調(diào)整濃度至10‘Bx，并用堿液將pH調(diào)制到6.0，接著添加瓊脂2%。確認所制成的斜面無雜菌污染后，接入黑曲霉孢子懸液0.1ml，于32℃培養(yǎng)4~5d。
2) 種子擴大培養(yǎng)
① 二級擴大培養(yǎng)
a 培養(yǎng)基
有瓊脂固體培養(yǎng)和液體表面培養(yǎng)兩種方法，前者的培養(yǎng)基組成與斜面培養(yǎng)基相同，后者的組成如下：
麥芽汁70BX， 氯化銨2%， 尿素0.1%，
b 培養(yǎng)
固體培養(yǎng)時，500ml茄子瓶裝80ml瓊脂培養(yǎng)基，250茄子瓶裝50ml瓊脂培養(yǎng)基。滅菌后擺成斜面，凝固后的斜面至37℃下培養(yǎng)24h。確認無雜菌污染即可使用。
液體培養(yǎng)時，將液體培養(yǎng)基裝入三角瓶中，使液層深度達45cm，于0.1MPa下濕熱滅菌15min。按無菌操作接種。培養(yǎng)溫度32℃。液體表面需7~10d，瓊脂固體培養(yǎng)需6~7d。
② 三級擴大培養(yǎng)
可采用麩曲固定培養(yǎng)、液體表面培養(yǎng)或瓊脂固定培養(yǎng)。
所用培養(yǎng)基如下：
a 麩曲培養(yǎng)基：
新鮮小麥麩皮1kg，加水1.1~1.3L。液體培養(yǎng)基與第二級擴大培養(yǎng)基所用液體培養(yǎng)基相同。
b瓊脂固體培養(yǎng)基：
與斜面培養(yǎng)基相同。
3） 發(fā)酵生產(chǎn)
① 工藝流程
以薯干粉為原料的液體深層發(fā)酵工藝流程：
斜面菌種→麩曲瓶→種子
↓
薯干粉→調(diào)漿→滅菌(間歇或連續(xù)式)→冷卻→發(fā)酵→發(fā)酵液→提取→成品
↑
無菌空氣
以薯渣為原料的固體發(fā)酵工藝流程：
試管斜面→三角瓶菌種→種曲
↓
薯渣→粉碎→蒸煮→攤涼接種→裝盤→發(fā)酵→出曲→提取→成品
↑
米糠
② 液體發(fā)酵
a不置換法
培養(yǎng)液一次加入，發(fā)酵結(jié)束后棄去菌蓋，發(fā)酵液用來提取檸檬酸。具體操作是：接種后，培養(yǎng)溫度維持在35℃，這是黑曲霉的適宜生長溫度，需維持72h左右，以促進孢子發(fā)芽及菌體發(fā)育。當溫度逐漸下降時，必須通人約50℃的空氣以維持35℃的培養(yǎng)溫度，通風量為3~5m3/m2.h。接種后20h左右可出現(xiàn)灰白色、很薄的菌膜，72h時菌膜已完全形成，菌膜相當厚且有皺褶。48h起由于菌體耗氧增加，可開動另一組風管向盤層之間通汽，進汽溫度為40℃左右，風量為7m3/m2.h，進汽濕度為75%以上，以防培養(yǎng)液水分蒸發(fā)過快。自接種后72h起進入產(chǎn)酸期，這時菌體代謝速率高，耗糖快，發(fā)酵液酸度急劇升高，并釋放出大量熱，最高時可達1000kJ/(m2.h)，此時應(yīng)加強通風措施，嚴格將發(fā)酵溫度控制在26~28℃，以利檸檬酸的形成。因此，一般在進入產(chǎn)酸期前8h左右需增大風量至15~18m3/m2.h，且降低進汽溫度在25℃以下，濕度仍在75%以上。160h以后發(fā)酵結(jié)束。
b 置換法
置換法一般是采用糖濃度低而營養(yǎng)較豐富的培養(yǎng)液先培養(yǎng)菌蓋，待菌蓋形成之后再更換發(fā)酵培養(yǎng)基�？筛鼡Q1次也可數(shù)次，發(fā)酵液用來提取檸檬酸。培養(yǎng)菌蓋，一般使用5%的糖液，視糖蜜質(zhì)量再補充少量NH4NO3、K2HPO4等鹽類。接種孢子后，室溫保持在34~36℃，培養(yǎng)液品溫為32~34℃，使孢子發(fā)芽，正常情況下40h即可形成緊密有皺的菌蓋。菌蓋形成后，放掉培養(yǎng)基，更換發(fā)酵培養(yǎng)基(即第1次置換)，并將室溫降至30~32℃，待發(fā)酵48~60h后再放掉發(fā)酵液，加入新培養(yǎng)液即進行第2次置換。如此重復(fù)，一般可置換培養(yǎng)基8~10次，總發(fā)酵周期為14~20d，收集起來的發(fā)酵液，用來提取檸檬酸。置換法的優(yōu)點是節(jié)省了大量培菌時間，發(fā)酵速度’快，而且原本不適宜長菌的原料卻可用作發(fā)酵培養(yǎng)基。但為了保持菌蓋的高活性，因此不能將發(fā)酵液殘?zhí)强刂频煤艿停@樣一來就造成替換出來的發(fā)酵液其殘?zhí)橇枯^高，給后道提取檸檬酸帶來困難。
c 不置換法影響表面發(fā)酵的因素
a) 培養(yǎng)液層厚度
培養(yǎng)基液層厚度大，發(fā)酵產(chǎn)物總的生成量就大。如果原料質(zhì)量好，預(yù)處理方法得當，曲霉菌絲體活力強，那末可適當增加液層厚度;相反，就應(yīng)減少液層厚度。
b) 糖濃度
用于表面發(fā)酵的糖蜜濃度，質(zhì)優(yōu)的糖蜜濃度(以蔗糖濃度計)為18%~22%較適宜，而質(zhì)劣的糖蜜一般采用14%。在表面發(fā)酵中，大約80%的糖被用于合成檸檬酸，菌體生長增殖耗糖8%左右，菌體進行呼吸消耗的糖在10%左右，另有1%~2%的糖用于合成副產(chǎn)物。
c) 溫度
黑曲霉適宜產(chǎn)酸溫度是26~28℃。溫度高，容易形成雜酸等副產(chǎn)物且菌體易衰老；溫度低，發(fā)酵周期被延長。
d) pH值
黑曲霉長菌的最適pH為中性，而產(chǎn)酸的最適pH在2.5~2.0。因此，應(yīng)該注意的是：菌蓋形成之后，只是在菌蓋下面有一個低PH區(qū)域，菌體合成檸檬酸的活動都是在這低pH區(qū)域內(nèi)進行的，所以不應(yīng)該攪動發(fā)液，避免低值區(qū)域的pH值上升而長菌不產(chǎn)酸。
e) 通風
表面發(fā)酵是氣相傳氧，因此傳氧效率較高，所以只要保持發(fā)酵室內(nèi)有適當空氣流通就可以滿足霉菌對氧的需要。較高度的CO2會影響菌體的生長和降低產(chǎn)酸能力。一般將CO2控制在3%以下即可。
② 固體發(fā)酵
a 淺盤發(fā)酵
將曲置于曲室內(nèi)培養(yǎng)，室溫可按需要調(diào)節(jié)。在孢子發(fā)芽和菌絲生長期，由于產(chǎn)生的熱量少，品溫會逐漸下降，在入室后自18h內(nèi)，應(yīng)維持品溫在27~31℃。培養(yǎng)18~48h期間，由于發(fā)酵熱的大量釋放，品溫上升很快，應(yīng)采取措施，不得讓品溫超過43℃，因為菌體活力下降，所以品溫會下降，此時應(yīng)維持在35℃左右，直至發(fā)酵結(jié)束。為了克服上、下曲盤的溫差，在發(fā)酵40h左右時應(yīng)將曲盤上下對調(diào)。整個發(fā)酵期間不必翻曲。曲室相對濕度在85%~90%。發(fā)酵終點根據(jù)酸度來判定，從48h開始測量酸度，以后每隔12h測定1次，自72h以后則每隔4h測定1次，在酸度達到最高時即出料，否則時間延長，檸檬酸反而被菌體消化。
b 厚層通風發(fā)酵
與淺盤發(fā)酵明顯不同的是，在物料鋪攤厚度上，厚層發(fā)酵的曲醅厚度在50cm左右，比淺盤發(fā)酵的15~20cm要大出許多。為了給曲霉菌提供氧，在培養(yǎng)過程中需要進行機械通風。培養(yǎng)過程中的溫度控制與淺盤發(fā)酵的溫度管理相似，但最高品溫不能超過40℃。溫度和濕度主要靠通風來調(diào)節(jié)，因為物料厚度大，所以培養(yǎng)過程中需要翻料。厚層發(fā)酵比淺盤發(fā)酵優(yōu)越之處在于：占地面積少，污染雜菌可能性小，機械化程度高。
3.5 蘋果酸
L-蘋果酸廣泛存在于生物體中，是生物體三羧酸循環(huán)的成員。蘋果酸廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域。因為蘋果酸具有比檸檬酸柔和的酸味，滯留時間長和口味更好的優(yōu)點，所以作為食品酸味劑更為理想。
許多微生物都能產(chǎn)生蘋果酸，但能在培養(yǎng)液中積累蘋果酸并適合于工業(yè)生產(chǎn)的，目前僅限于少數(shù)幾種，大致有：用于一步發(fā)酵法的黃曲霉、米曲霉、寄生曲霉；用于兩步發(fā)酵法的華根霉、無根根霉、短乳桿菌、膜睽畢赤酵母；用于酶轉(zhuǎn)化法的短乳桿菌、大腸桿菌、產(chǎn)氨短桿菌、黃色短桿菌。
3.5.1 一步發(fā)酵法
以糖類為發(fā)酵原料，用霉菌直接發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸的方法稱為一步發(fā)酵法。
1) 菌種
一步發(fā)酵法采用黃曲霉A-114生產(chǎn)蘋果酸。
2) 種子培養(yǎng)基組成(%)
C6H12O6 3，豆餅粉1， FeSO4 0.05，K2HPO4 0.02，NaCl 0.001，MgSO4 0.01，CaCO3 6(單獨滅菌)。
3) 種子培養(yǎng)
將保存在麥芽汁瓊脂斜面上的黃曲霉孢子用無菌水洗下并移接到裝有100ml種子培養(yǎng)基的500m1三角瓶中，在33℃下靜置培養(yǎng)2~4d，待長出大量孢子后，將其轉(zhuǎn)入到種子罐擴大培養(yǎng)，接種量為5%。種子罐的培養(yǎng)基與三角瓶培養(yǎng)基的組成相同，只是另外添加0.4%(體積分數(shù))泡敵。種子罐的裝液量為70%，罐壓0.1MPa，培養(yǎng)溫度33~34℃，通風量0.15~0.3m3/m3.min，培養(yǎng)時間18~20h。
4) 發(fā)酵培養(yǎng)基組成
C6H12O6 7%~8%，其余成分的組成及用量與種子罐培養(yǎng)基相同。
5) 發(fā)酵
發(fā)酵罐的裝液量為70%，接種量10%，罐壓0.1MPa，培養(yǎng)溫度33~34℃，通風量0.7m3/（m3.min)，攪拌轉(zhuǎn)速180r/min，發(fā)酵時間40h左右。發(fā)酵過程中由自動系統(tǒng)控制滴加泡敵，防止泡沫產(chǎn)生過多。當殘?zhí)窃?%以下時，終止發(fā)酵，產(chǎn)蘋果酸7%。
3.5.2 兩步發(fā)酵法
兩步發(fā)酵法是以糖類為原料，先由根霉菌發(fā)酵生成富馬酸(延胡索酸)和蘋果酸的混合物，然后接人酵母或細菌，將混合物中的富馬酸轉(zhuǎn)化為蘋果酸。
1) 富馬酸發(fā)酵
① 菌種
兩步發(fā)酵法以華根霉6508為菌種生產(chǎn)蘋果酸。
② 斜面培養(yǎng)
華根霉6508于葡萄糖馬鈴薯汁瓊脂斜面上，30℃培養(yǎng)7d，易于長出大量孢子。
③ 搖瓶發(fā)酵
a 培養(yǎng)基組成(%)
C6H12O6 10，(NH4)2SO4 0.5，K2HPO4 0.1，聚乙二醇10，MgSO4 0.05，F(xiàn)eCl3 0.002，CaCO3 5(單獨滅菌)。
b 富馬酸發(fā)酵
在500ml三角瓶中裝入50ml培養(yǎng)基，滅菌，冷卻。接種華根霉孢子，置往復(fù)式搖床上，于30℃下培養(yǎng)4~5d，發(fā)酵得到含富馬酸和蘋果酸的混合液。
c 轉(zhuǎn)換發(fā)酵
a) 酶轉(zhuǎn)化法
酶轉(zhuǎn)化法是國外用來生產(chǎn)L-蘋果酸的主要方法。酶轉(zhuǎn)化法是以富馬酸鹽為原料，利用微生物的富馬酸酶轉(zhuǎn)化成蘋果酸(鹽)。酶轉(zhuǎn)化法可分為游離細胞酶法、固定化細胞酶法。
b) 游離細胞酶轉(zhuǎn)化法
酶轉(zhuǎn)化方法 在pH7.5含18%富馬酸的溶液中接入2%濕菌體，于35℃、150r/min條件下轉(zhuǎn)化24~36h。轉(zhuǎn)化率達90%以上。
c) 固定化細胞酶轉(zhuǎn)化法
目前，研究得最多的是以產(chǎn)氨短桿菌或黃色短桿菌為菌種，將化學法合成的富馬酸鈉作為底物，進行固定化細胞生產(chǎn)蘋果酸。使用固定化細胞易于生成與蘋果酸難以分離的琥珀酸。因此，細胞被固定以后必須經(jīng)化學試劑處理，以防止這種副反應(yīng)的發(fā)生。采用固定化技術(shù)必須注意以下幾個問題：
細胞被固定前富馬酸酶活力要高。當富馬酸酶活力較高時，即使固定化細胞的酶活力有所下降，仍可以保證有較高的轉(zhuǎn)化力；使用的固定化方法對酶的損害較小，細胞被固定后能保持較高的酶活力；細胞被固定后不應(yīng)引起副反應(yīng)的發(fā)生；固定化細胞應(yīng)有高度的操作穩(wěn)定性；
3.5.3 蘋果酸的提取和精制
1) 從發(fā)酵醪液中提取蘋果酸
① 工藝流程
發(fā)酵液→酸解→過濾→濾液→中和→過濾→沉淀→酸解→過濾→濾液→精制→濃縮→結(jié)品→干燥→成品
② 操作方法
在發(fā)酵醪液中邊攪拌邊加入無砷硫酸，將pH值調(diào)節(jié)至1.5左右；過濾除去沉淀后，在濾液中加入碳酸鈣，直到不再有CO2放出，此時生成蘋果酸鈣；接著，用石灰乳將體系的pH值調(diào)至7.5，靜置6~8h。過濾，收集蘋果酸鈣沉淀，并用少量冷水洗去沉淀中的殘?zhí)呛推渌扇苄噪s質(zhì)；在蘋果酸鈣鹽中加入近一倍量的溫水，攪拌成懸濁液，接著加入無砷硫酸，使pH達到1.5左右，繼續(xù)攪拌30min，最后靜置數(shù)小時，使石膏渣沉淀充分析出；過濾，制得粗制蘋果酸溶液，其中含有微量富馬酸、Fe2+、Ca2+、Mg2+和色素；從聯(lián)合柱流出的高純度蘋果酸溶液，在70℃下減壓濃縮到蘋果酸濃度為65%~80%，然后冷卻至20℃，添加晶種析晶；晶體于40~50℃下真空干燥，得蘋果酸成品。
2) 從混雜富馬酸發(fā)酵醪液中提取蘋果酸
① 工藝流程
發(fā)酵廖液→濃縮→析出富馬酸結(jié)晶→過濾→濾液→濃縮→析出富馬酸結(jié)晶→過濾→濾液→冷卻，加晶種→蘋果酸結(jié)晶→干燥→成品
② 操作方法
將發(fā)酵醪液濃縮到蘋果酸濃度為50%并冷卻至20~30℃，使富馬酸結(jié)晶析出；
過濾除去富馬酸后，母液在70℃下減壓濃縮到蘋果酸濃度為65%~80%，再冷卻至20℃使富馬酸結(jié)晶再次析出。為了防止蘋果酸與富馬酸同時析出，造成蘋果酸提取收率下降，結(jié)溫度不宜低于20℃；
將過濾除去富馬酸結(jié)晶后的蘋果酸溶液冷卻至20℃，投入蘋果酸品種，緩慢攪拌，使蘋果酸結(jié)晶徐徐析出。
2) 從酶法轉(zhuǎn)化液中提取蘋果酸
從固定化細胞反應(yīng)柱中流出的酶法轉(zhuǎn)化液是清亮的，其中蘋果酸鹽含量為12.5%左右，富馬酸鹽含量為3%左右。在上述轉(zhuǎn)化液中加入硫酸，使富馬酸結(jié)晶析出，過濾后往濾液中添加碳酸鈣，使蘋果酸形成蘋果酸鈣沉淀析出。將蘋果酸鈣沉淀用硫酸酸解，酸解液經(jīng)陰離子交換樹脂處理后濃縮結(jié)晶，得蘋果酸成品。游離細胞酶法轉(zhuǎn)化液在除去細胞和其他不溶物后，按上述方法處理。
3.1 生產(chǎn)用霉菌菌種
淀粉的糖化、蛋白質(zhì)的水解均是通過霉菌產(chǎn)生的淀粉酶和蛋白質(zhì)水解酶進行的。通常情況是先進行霉菌培養(yǎng)制曲。淀粉、蛋白質(zhì)原料經(jīng)過蒸煮糊化加入種曲，在一定溫度下培養(yǎng)，曲中由霉菌產(chǎn)生的各種酶起作用，將淀粉、蛋白質(zhì)分解成糖、氨基酸等水解產(chǎn)物。
在生產(chǎn)中利用霉菌作為糖化菌種很多。根霉屬中常用的有日本根霉(Rhizopus japonicus AS3. 849)、米根霉(Rhizopus oryzae)、華根霉(Rhizopus chinensis〉等；曲霉屬中常用的有黑曲霉(Aspergillus niger)、宇佐美曲霉(Asp. usamii)、米曲霉(Asp. oryzae)和泡盛曲霉(Asp. awamori)等；毛霉屬中常用的有魯氏毛霉(Mucor rouxii)，還有紅曲屬(Monascus)中的一些種也是較好的糖化劑，如紫紅曲霉(Monascus. Purpurens)、安氏紅曲霉(Monascus. anka)、銹色紅曲霉(Monascus. rubiginosusr)、變紅曲霉(Monascus. serorubescons AS3.976)等。
3.2 醬類
醬類包括大豆醬、蠶豆醬、面醬、豆瓣醬、豆豉及其加工制品，都是由一些糧食和油料作物為主要原料，利用以米曲霉為主的微生物經(jīng)發(fā)酵釀制的。醬類發(fā)酵制品營養(yǎng)豐富，易于消化吸收，即可作小菜，又是調(diào)味品，具有特有的色、香、味，價格便宜，是一種受歡迎的大眾化調(diào)味品。
用于醬類生產(chǎn)的霉菌主要是米曲霉（Asp.oryzae），生產(chǎn)上常用的有滬釀3.042，黃曲霉Cr-1菌株（不產(chǎn)生毒素），黑曲霉（Asp. Nigerf-27）等。所用的曲霉具有較強的蛋白酶、淀粉酶及纖維素酶的活力，它們把原料中的蛋白質(zhì)分解為氨基酸，淀粉變?yōu)樘穷�，在其他微生物的共同作用下生成醇、酸、酯等，形成醬類特有的風味。
市場上的豆醬種類繁多，其生產(chǎn)釀造工藝也不盡相同，生產(chǎn)用原輔料差異很大。下面是大豆醬的生產(chǎn)工藝。
3.2.1 制曲工藝
1) 制曲工藝流程
水 水 面粉 種曲
↓ ↓ ↓ ↓
大豆→洗凈→浸泡→蒸煮→冷卻→混合→接種→厚層通風培養(yǎng)→大豆曲
2) 制曲原料的處理
大豆洗凈、浸泡及蒸熟；面粉在過去采用炒焙方法，現(xiàn)在有些廠家直接利用生面粉而不預(yù)以處理。
3) 制曲操作
制曲時原料配比為大豆100kg，標準粉40~60kg。種曲用量為0.15%~0.3%，種曲使用時先與面粉拌和。為了使豆醬中麩皮含量減少，種曲最好用分離出的孢子（曲精）；由于豆粒較大，水分不易散發(fā)，制曲時間適當延長。
4) 制醬
①工藝流程
配制→澄清→鹽水加熱————————————∣
↓ ↓
大豆曲→發(fā)酵容器→自然升溫→加第一次鹽水→醬醅保溫發(fā)酵→加第二次鹽水及鹽→翻醬→成品
② 制醬工藝
先將大豆曲倒入發(fā)酵容器內(nèi)，表面扒平，稍予壓實，很快會自然升溫至40℃左右。在將準備好的14.5oB′熱鹽水（加熱至60~65℃）加至面層，讓它逐漸全部滲入曲內(nèi)。最后面層加封面用細鹽一層，并將蓋蓋好。大豆曲加入熱鹽水后，醅溫即能達到45℃左右，以后維持此溫度10d，醬醅就成熟。發(fā)酵完畢，補加240Be′鹽水及所需細鹽（包括封面鹽），壓縮空氣或翻醬機充分攪拌，務(wù)使所加的細鹽全部溶化，同時混合均勻，在室溫中后發(fā)酵即的成品。
3.3 醬油
醬油是人們常用的一種食品調(diào)味料，營養(yǎng)豐富，味道鮮美，在我國已有兩千多年的歷史。它是用蛋白質(zhì)原料(如豆餅、豆柏等)和淀粉質(zhì)原料(如麩皮、面粉、小麥等)，利用曲霉及其他微生物的共同發(fā)酵作用釀制而成的。
醬油生產(chǎn)中常用的霉菌有米曲霉、黃曲霉和黑曲霉等，應(yīng)用于醬油生產(chǎn)的曲霉菌株應(yīng)符合如下條件：不產(chǎn)黃曲霉毒素；蛋白酶、淀粉酶活力高，有谷氨酰胺酶活力；生長快速、培養(yǎng)條件粗放、抗雜菌能力強；不產(chǎn)生異味，制曲釀造的醬制品風味好。
3.3.1 醬油生產(chǎn)霉菌
醬油生產(chǎn)所用的霉菌主要是米曲霉(Asp. Oryzae)。生產(chǎn)上常用的米曲霉菌株有：AS 3.951(滬釀3.042)；UE328、UE336；AS 3.863；渝3.811等。
生產(chǎn)中常常是由兩菌種以上復(fù)合使用，以提高原料蛋白質(zhì)及碳水化合物的利用率，提高成品中還原糖、氨基酸、色素以及香味物質(zhì)的水平。除曲霉外，還有酵母菌、乳酸菌參與發(fā)酵，它們對醬油香味的形成也起著十分重要的作用。
3.3.2 種曲原料及其配比
目前一般采用的幾種配比：
麩皮80kg、面粉（或甘薯干粉）20kg、水70kg左右； 麩皮85kg、面粉85kg、水90kg、麩皮100kg、水95~100kg；
3.3.3 原料處理
先將麩皮與輔料用拌和機拌勻，再加水充分拌和。由于一次加水蒸煮后熟料粘度高，團快多，過篩困難，應(yīng)采用兩次潤水方法。即在混合原料中先加40%~50%的水，蒸熟過篩后再補充清潔的冷開水30%~45%。為防止雜菌的污染，可在冷開水中添加按總原料計0.3%的食用級冰醋酸或0.5~1%的醋酸鈉拌勻。蒸料時先開起蒸汽，排盡冷水，分層進料。注意原料必須灑于冒蒸氣處，灑料要求松散，切忌將原料壓實而堵塞蒸氣，導(dǎo)致蒸料不勻。進料完畢、全面冒汽后加蓋蒸煮。常壓蒸煮冒汽后維持1h，燜30min，或采用加壓蒸煮0.1Mpa維持30min出鍋，然后過篩，移入拌和臺上攤開，適當翻拌，使之快速冷卻。
3.3.4 種曲制備
1) 工藝流程
一級種→二級種→三級種
↓
麩皮、面粉→加水混合→蒸料→過篩→冷卻→接種→裝匾→曲室培養(yǎng)→種曲
2) 試管斜面菌種培養(yǎng)
① 培養(yǎng)基
5°Be′豆餅汁100ml，MgSO4 0.05g，NaH2PO4 0.1g，可溶性淀粉2.0g，瓊脂1.5g，0.1MPa蒸汽滅菌30min，制成斜面試管。
② 培養(yǎng)
將菌種接入斜面，置30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，待長出茂盛的黃綠色孢子，并無雜菌，即可作為三角瓶菌種擴大培養(yǎng)。
3) 三角瓶純菌種擴大培養(yǎng)
① 培養(yǎng)基
麩皮80g，面粉20g，水80-90ml或麩皮85g，豆餅粉15g，水95ml。原料混合均勻分裝入帶棉塞的三角瓶中，瓶中料厚度1cm左右，在0.1MPa蒸汽壓力下滅菌30min，滅菌后趁熱搖松曲料。
② 培養(yǎng)
曲料冷卻后接入試管斜面菌種，搖勻，置30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18h左右，當瓶內(nèi)曲料已發(fā)白結(jié)餅，搖瓶一次，將結(jié)塊搖碎，繼續(xù)培養(yǎng)4h，再搖瓶一次，經(jīng)過2d培養(yǎng)，把三角瓶倒置，以促進底部曲霉生長，繼續(xù)培養(yǎng)1d，待全部長滿黃綠色的孢子即可使用。若放置較長時間，應(yīng)陰涼處或冰箱中。
4) 種曲培養(yǎng)
① 曲料配比
目前一般采用的配比有兩種： 麩皮80kg，面粉20kg，水70kg左右；麩皮100kg，水95~100kg。加水量應(yīng)視原料的性質(zhì)而定。根據(jù)經(jīng)驗，使拌料后的原料能捏成團，觸之即碎為宜。原料拌勻后過3.5目篩。堆積潤水1h，0.1MPa蒸汽壓下蒸料30min，或常壓蒸料1h再燜30min 。要求熟料疏松，含水量50%~54%。
② 培養(yǎng)
待曲料品溫降至40℃左右即可接種，將三角瓶的種曲散布于曲料中，翻拌均勻，使米曲霉孢子與曲料充分混勻，接種量一般為0.5%~1%。制種曲的兩種常用方法：
a 竹匾培養(yǎng)
接種完畢，曲料移入竹匾內(nèi)攤平，厚度約2cm，種曲室溫度控制在28~30℃，培養(yǎng)16h左右，當曲料上出現(xiàn)白色菌絲，品溫升高到38℃左右時可進行翻曲。翻曲前調(diào)換曲室的空氣，將曲塊用手捏碎，用噴霧器補加40℃左右的無菌水，補加水量40%左右，噴水完畢，再過篩1次，使水分均勻。然后分匾攤平，厚度1cm，上蓋溫紗布，以保持足夠的溫度。翻曲后，種曲室溫控制在26~28℃之間，4~6h后，可見面上菌絲生長，這一階段必須注意品溫，隨時調(diào)整竹匾上下位置及室溫，務(wù)使品溫不超過38℃，并經(jīng)常保持紗布潮濕，這是制好種曲的關(guān)鍵。若品溫過高，會影響發(fā)芽率。再經(jīng)過10h左右，曲料呈淡黃綠色，品溫下降至32~35℃。在室溫28~30℃下，繼續(xù)培養(yǎng)35h左右，曲料上長滿孢子，此時可以揭去紗布，開窗放出室內(nèi)濕氣，并控制室溫略高于30℃，以促進孢子完全成熟。整個培養(yǎng)時間需68-72h。
b 曲盤培養(yǎng)
接種完畢，曲料裝入曲盤內(nèi)，將曲盤柱形堆疊于曲室內(nèi)，室溫28~30℃，培養(yǎng)16h左右。當曲面面層稍有發(fā)白、結(jié)塊，品溫達到40℃時，進行第一次翻曲。翻曲后，曲盤改為品字形堆疊，控制品溫28~30℃，4~6h后品溫上升到36℃，即進行第二次翻曲。每翻畢一盤，盤上蓋滅菌的草簾一張，控制品溫36℃，再培養(yǎng)30h后揭去草簾，繼續(xù)培養(yǎng)24h左右，種曲成熟。
3.3.5 成曲生產(chǎn)
1) 工藝流程
種曲
↓
原料→粉碎→潤水→蒸料→冷卻→接種→通風培養(yǎng)→成曲
2) 發(fā)酵
① 原料的選擇和配比
醬油生產(chǎn)中是以釀制醬油的全部蛋白質(zhì)原料和淀粉質(zhì)原料制曲后，再經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)醬油的。所以制曲原料的選用，即要滿足米曲霉正常生長繁殖和產(chǎn)酶，又要考慮到醬油本身質(zhì)量的需要。脫脂大豆的蛋白質(zhì)含量非常豐富，宜作原料；麩皮質(zhì)地疏松，適合于米曲霉的生長和產(chǎn)酶，因此，可以作輔料。制曲的配比生產(chǎn)廠家不進相同。醬油的鮮味主要來源于原料中的蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物氨基酸，而醬油的香甜則來源于原料中淀粉分解產(chǎn)物糖及發(fā)酵生成的醇、酯等物質(zhì)，所以，若需釀制香甜味濃厚、體態(tài)粘稠的醬油，則在配比中要適當增加淀粉質(zhì)原料。使用豆粕（豆餅）和麩皮為原料，常用的配比是：8：2、7：3、6：4和5：5。
② 制曲原料的處理
a 原料粉碎及潤水
豆餅粉碎使其有適當?shù)牧６龋阌跐櫵驼糁�。一般若原料顆粒小，則表面積大，米曲霉生長繁殖面積大，原料利用率高。粉碎后的豆餅與麩皮按一定的比例充分的拌勻后，即可進行潤水。所謂潤水，就是給原料加上適當?shù)乃�，并使原料均勻而完全地吸收水分的工藝。其目的在于使原料吸收一定量水分后膨脹、松軟，在蒸煮時蛋白質(zhì)容易達到適度的變性；淀粉充分的糊化；溶出曲霉生長所需的營養(yǎng)成分，也為曲霉生長提供了所需的水分。
b 原料蒸料
使原料中蛋白質(zhì)達到適度變性，成為酶易作用的狀態(tài)。使原料中的淀粉充分糊化，以利于糖化；殺滅原料中的雜菌，減少制曲時的污染；要蒸料均勻并掌握蒸料的最適程度，達到原料蛋白質(zhì)的適度變性；防止蒸料不透或不均勻而存在未變性的蛋白質(zhì)，或蒸煮過度而過度變性使蛋白質(zhì)發(fā)生褐變現(xiàn)象。蒸料的設(shè)備目前國內(nèi)蒸煮設(shè)備有三種類型，即常壓蒸煮鍋、加壓蒸煮鍋和連續(xù)管道蒸煮設(shè)備。目前國內(nèi)醬油廠大多使用旋轉(zhuǎn)式加壓蒸煮鍋。
③ 厚層通風制曲
就是將曲料置于曲池（也稱曲箱）內(nèi)，其厚度增至30cm左右，利于通風機供給空氣及調(diào)節(jié)溫度，促使半曲霉迅速生長繁殖。
a 制曲時原料的物理變化
曲霉在曲料上生長的變化：曲料制種進入曲箱后，米曲霉得到適當?shù)臏囟群退�，開始發(fā)芽生長。曲霉的最適發(fā)芽溫度為30~32℃。通風制曲開始時的堆積，品溫以維持32℃左右為宜。在最初的4~5d是米曲霉的孢子發(fā)芽階段，所以成為孢子發(fā)芽期。
b 制曲時霉菌的生物學變化
孢子發(fā)芽后，接著生長菌絲。當靜止培養(yǎng)8h左右時，品溫已逐漸上升到36℃，需要進行間歇或連續(xù)通風，一方面調(diào)節(jié)品溫，另一方面換新鮮空氣，以利米曲霉生長。繼續(xù)維持品溫在35℃左右，培養(yǎng)12h左右，當肉眼稍見曲料發(fā)白時進行第一次翻曲，稱為菌絲生長期。
④ 固態(tài)低鹽發(fā)酵
在醬油發(fā)酵過程中，根據(jù)醪醅的狀態(tài)，有稀醪發(fā)酵、固態(tài)發(fā)酵及固稀發(fā)酵之分；根據(jù)加鹽量的多少，可分為高鹽發(fā)酵、低鹽發(fā)酵和無鹽發(fā)酵三種；根據(jù)加溫狀況不同，又可分為曬夜露與保溫速釀兩類。
a 工藝流程
成曲→打碎→加鹽水拌合(在12~13°Be′，55℃左右的鹽水，含水量50%~55%等條件下)→保溫發(fā)酵(50~55℃，4~6d)→成熟醬醅
b 固態(tài)低鹽發(fā)酵工藝
a) 食鹽水的配制
食鹽溶解后，以波美計測定其濃度，并根據(jù)當時溫度調(diào)整到規(guī)定的濃度。一般經(jīng)驗是100kg水加鹽1.5kg左右得鹽水10°Be′，但往往因食鹽質(zhì)量不同及溫度不同而需要增減用鹽量。采用波美計檢定鹽水濃度二般是以20℃為標準溫度，而實際生產(chǎn)上配制鹽水時，往往高于或低于此溫度，因此，必須換算成標準溫度。
b) 發(fā)酵料的配制
先將已準備好的糖漿鹽水加熱到50~55℃(根據(jù)下池后發(fā)酵品溫的要求，掌握糖漿鹽水溫度的高低)，再將成曲通過制醅機的碎曲齒，由升高機的提升斗，輸入螺旋拌和器中與糖漿鹽水一起拌和均勻，落人發(fā)酵池內(nèi)。初開始時，池底15cm左右的成曲拌糖漿鹽水略少，以后用閥門掌握成曲與糖漿鹽水的流速數(shù)量，使拌曲完畢后，多出150kg左右的糖漿鹽水，將此糖漿鹽水澆于料面。待糖漿鹽水全部吸人料內(nèi)，最后面層加蓋聚乙烯薄膜，四周加鹽將膜壓緊，并在指定的點上插入溫度計，池面加蓋。
如果不用酶法生產(chǎn)，即將淀粉質(zhì)原料與豆餅一起混合，經(jīng)過潤水、蒸煮及制曲后，直接加入12~180°Be′熱鹽水(55℃左右)，
c) 保溫發(fā)酵及管理
保溫發(fā)酵時溫度與時間的掌握，各廠根據(jù)設(shè)備情況及要求的不同而各異。發(fā)酵時，成曲與糖漿鹽水拌和人池后，醬醅品溫要求在42~46℃之間，保持4d，在此期間，品溫基本穩(wěn)定，夏天不需要開蒸氣保溫，冬天如醋溫不足需要進行保溫。從第5d起按每天開汽3次的辦法使品溫逐步上升，最后提高到48~50℃。低鹽發(fā)哮的時間一般為10d，醬醅已基本上成熟。但為了增加風味，往往延長發(fā)酵期12~15d，發(fā)酵溫度前期為42~44℃，中間為44~46℃，后期為46~48℃。有的廠還采用淋澆發(fā)酵的辦法，醬醅面上不封鹽，制醅后相隔2~3h將醬汁(曲液水)先回澆一次于醬醅內(nèi)，使酶和水分較為均勻。發(fā)酵溫度5d天內(nèi)為40~45℃，5天后逐步提高品溫至45~48℃。前4d每天淋澆兩次，4d后每天淋澆一次。發(fā)酵期共為10d。淋澆對發(fā)酵是有好處的，使發(fā)酵溫度均勻，醬汁中的酶充分利用，并且可以減少面層的氧化層，因而能提高醬油的風味。它的缺點是需要增加淋澆設(shè)備與淋澆操作，在工藝上帶來不方便。
固態(tài)低鹽發(fā)酵期間要有專人負責，按時測定醬醋溫度，做好記錄。冬天要防止四周及面層的醬醋溫度過低。如發(fā)現(xiàn)不正常狀況，必須及時采取適當?shù)拇胧?
⑤ 浸出提油及成品配制
a 工藝流程
二油 三油 水
↓ ↓ ↓
加熱 加熱 加熱
↓ ↓ ↓
成熟醬醅→第一次浸泡→頭渣→第二次浸泡→二渣→第三次浸泡→殘渣
↓ ↓ ↓
第一濾油 第二濾油 第三濾油
↓ ↓ ↓
頭油 二油 三油
b 成品配制
以上提取的頭油和二油并不是成品，必須按統(tǒng)一的質(zhì)量標準或不同的食用用途進行配兌，調(diào)配好的醬油還須經(jīng)滅菌、包裝，并經(jīng)檢驗合格后才能出廠。
3.4 檸檬酸
檸檬酸(Citric acid)分子式為C6H807。又名枸櫞酸，外觀為白色顆粒狀或白色結(jié)晶粉末，無臭，具有另人愉快的強烈的酸味，相對密度為1.6550。檸檬酸易溶于水、酒精、不溶于醚、酯、氯仿等有機溶劑。商品檸檬酸主要是無水檸檬酸和一水檸檬酸，前者在高于36.6℃的水溶液中結(jié)晶析出，后者在低于36.6℃水溶液中結(jié)晶析出。它天然存在于果實中，其中以柑桔、菠蘿、檸檬、無花果等含量較高。檸檬酸是生物體主要代謝產(chǎn)物之一。早期的檸檬酸生產(chǎn)是以檸檬、柑桔等天然果實為原料加工而成的。1893年德國微生物學家Wehmen發(fā)現(xiàn)二種青霉菌能夠積累檸檬酸，1923年美國科學家研究成功了以廢糖蜜為原料的淺盤法檸檬酸發(fā)酵，并設(shè)廠生產(chǎn)。1951年美國Miles公司首先采用深層發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)檸檬酸。我國1968年用薯干為原料采用深層發(fā)酵法生產(chǎn)檸檬酸成功，由于工藝簡單、原料豐富、發(fā)酵水平高，各地陸續(xù)辦廠投產(chǎn)，至20世紀70年代中期，檸檬酸工業(yè)已初步形成了生產(chǎn)體系。
3.4.1 檸檬酸在食品中的應(yīng)用
1) 飲料與冰淇淋
檸檬酸廣泛用于配制各種水果型的飲料以及軟飲料。檸檬酸本身是果汁的天然成分之一，不僅賦于飲料水果風味，而且具有增溶、緩沖、抗氧化等作用，能使飲料中的糖、香精、色素等成分交融協(xié)調(diào)，形成適宜的口味和風味；添加檸檬酸可以改善冰淇淋的口味，增加乳化穩(wěn)定性，防止氧化作用。
2) 果醬與釀造酒
檸檬酸在果醬與果凍中同樣可以增進風味，并使產(chǎn)品抗氧化作用。由于果醬、果凍的凝膠性質(zhì)需要一定范圍的pH值，添加一定量的檸檬酸可以滿足這一要求。
當葡萄或其它釀酒原料成熟過度而酸度不足時，可以用檸檬酸調(diào)節(jié)，以防止所釀造的酒口味單薄。檸檬酸加到這些果汁中還有抗氧化和保護色素的作用，以保護果汁的新鮮感和防止變色。
3) 腌制品
各種肉類和蔬菜在腌制加工時，加入或涂上檸檬酸可以改善風味，除腥去臭，抗氧化。
4) 罐頭食品
加入檸檬酸除了調(diào)酸作用之外，還有螯合金屬離子的作用，保護其中的抗壞血酸，使之不被金屬離子破壞。檸檬酸添加到植物油中也有類似的作用。
5) 豆制品及調(diào)味品
用含有檸檬酸的水浸漬大豆，可以脫腥并便于后續(xù)加工。檸檬酸可以用于大豆等豆類蛋白、葵花子蛋白的水解，生產(chǎn)出風味別致的調(diào)味品。它也可以用于成熟調(diào)味品（醬油等）的調(diào)味。
6) 其它
檸檬酸在醫(yī)藥、化學等其它工業(yè)中也有一定的作用。檸檬酸鐵胺可以用作補血劑；檸檬酸鈉可用作輸血劑；檸檬酸可制造食品包裝用薄膜及無公害洗滌劑。
3.4.2 檸檬酸發(fā)酵微生物
1) 黑曲霉（Aspergillus niger）的形態(tài)特征
目前生產(chǎn)上常用產(chǎn)酸能力強的黑曲霉作為生產(chǎn)菌。在固體培養(yǎng)基上，菌落由白色逐漸變至棕色。孢子區(qū)域為黑色，菌落呈絨毛狀，邊緣不整齊。菌絲有隔膜和分枝，是多細胞的菌絲體，無色或有色，有足細胞，頂囊生成一層或兩層小梗，小梗頂端產(chǎn)生一串串分生孢子。
2) 黑曲霉（Aspergillus niger）的生理特征
黑曲霉生產(chǎn)菌可在薯干粉、玉米粉、可溶性淀粉糖蜜、葡萄糖麥芽糖、糊精、乳糖等培養(yǎng)基上生長、產(chǎn)酸。黑曲霉生長最適pH值因菌種而異，一般為pH3~7；產(chǎn)酸最適pH為1.8~2.5。生長最適溫度為33~37℃，產(chǎn)酸最適溫度在28~37℃，溫度過高易形成雜酸，斜面培養(yǎng)要求在麥芽汁40Be′左右的培養(yǎng)基上。黑曲霉以無性生殖的形式繁殖，具有多種活力較強的酶系，能力用淀粉類物質(zhì)，并且對蛋白質(zhì)、單寧、纖維素、果膠等具有一定的分解能力。黑曲霉可以邊長菌、邊糖化、邊發(fā)酵產(chǎn)酸的方式生產(chǎn)檸檬酸。
3.4.3 檸檬酸發(fā)酵機理
關(guān)于檸檬酸發(fā)酵的機制雖有多種理論，但目前大多數(shù)學者認為它與三羧酸循環(huán)有密切的關(guān)系。糖經(jīng)糖酵解途徑(EMP途徑)，形成丙酮酸，丙酮酸羧化形成C4化合物，丙酮酸脫羧形成C2化合物，兩者縮合形成檸檬酸（見發(fā)酵代謝）。
3.4.4 檸檬酸發(fā)酵用原料
檸檬酸發(fā)酵的原料有糖質(zhì)原料(甘煎廢糖蜜、甜菜廢糖蜜)、淀粉質(zhì)原料(主要是番薯、馬鈴薯、木薯等)和正烷烴類原料三大類。
3.4.5 檸檬酸發(fā)酵工藝
1) 試管斜面菌種培養(yǎng)
察氏瓊脂培養(yǎng)基：NaNO3 3g， 蔗糖20g， K2HPO4 1g， KCl 0.5g， MgSO4.7 H2O 0.5g， FeSO4 0.01g， 瓊脂20g， 用水定溶至1000ml， pH自然。
察氏-多氏瓊脂培養(yǎng)基：蔗糖30g，NaNO3 2g， MgSO4.7H2O 0.5g， KH2PO4 1g， KCl 0.5g， FeSO4.7H2O 0.01g， 溴甲分綠0.4g，瓊脂20g， 蒸餾水1000ml， pH自然。
蔗糖合成瓊脂培養(yǎng)基：蔗糖140g， NH4NO3 2g， KH2PO4 2g， MgO4.7H2O 0.25g， FeCl3.6H2O 0.02g， MnSO4.4H2O 0.02g， 麥芽汁20ml， 瓊脂20g， 用水定溶至1000ml。
米曲汁瓊脂培養(yǎng)基：一份米曲加四倍質(zhì)量的水，于55℃保溫糖化3~4小時后煮沸，濾液用水調(diào)整濃度至10‘Bx，并用堿液將pH調(diào)制到6.0，接著添加瓊脂2%。確認所制成的斜面無雜菌污染后，接入黑曲霉孢子懸液0.1ml，于32℃培養(yǎng)4~5d。
2) 種子擴大培養(yǎng)
① 二級擴大培養(yǎng)
a 培養(yǎng)基
有瓊脂固體培養(yǎng)和液體表面培養(yǎng)兩種方法，前者的培養(yǎng)基組成與斜面培養(yǎng)基相同，后者的組成如下：
麥芽汁70BX， 氯化銨2%， 尿素0.1%，
b 培養(yǎng)
固體培養(yǎng)時，500ml茄子瓶裝80ml瓊脂培養(yǎng)基，250茄子瓶裝50ml瓊脂培養(yǎng)基。滅菌后擺成斜面，凝固后的斜面至37℃下培養(yǎng)24h。確認無雜菌污染即可使用。
液體培養(yǎng)時，將液體培養(yǎng)基裝入三角瓶中，使液層深度達45cm，于0.1MPa下濕熱滅菌15min。按無菌操作接種。培養(yǎng)溫度32℃。液體表面需7~10d，瓊脂固體培養(yǎng)需6~7d。
② 三級擴大培養(yǎng)
可采用麩曲固定培養(yǎng)、液體表面培養(yǎng)或瓊脂固定培養(yǎng)。
所用培養(yǎng)基如下：
a 麩曲培養(yǎng)基：
新鮮小麥麩皮1kg，加水1.1~1.3L。液體培養(yǎng)基與第二級擴大培養(yǎng)基所用液體培養(yǎng)基相同。
b瓊脂固體培養(yǎng)基：
與斜面培養(yǎng)基相同。
3） 發(fā)酵生產(chǎn)
① 工藝流程
以薯干粉為原料的液體深層發(fā)酵工藝流程：
斜面菌種→麩曲瓶→種子
↓
薯干粉→調(diào)漿→滅菌(間歇或連續(xù)式)→冷卻→發(fā)酵→發(fā)酵液→提取→成品
↑
無菌空氣
以薯渣為原料的固體發(fā)酵工藝流程：
試管斜面→三角瓶菌種→種曲
↓
薯渣→粉碎→蒸煮→攤涼接種→裝盤→發(fā)酵→出曲→提取→成品
↑
米糠
② 液體發(fā)酵
a不置換法
培養(yǎng)液一次加入，發(fā)酵結(jié)束后棄去菌蓋，發(fā)酵液用來提取檸檬酸。具體操作是：接種后，培養(yǎng)溫度維持在35℃，這是黑曲霉的適宜生長溫度，需維持72h左右，以促進孢子發(fā)芽及菌體發(fā)育。當溫度逐漸下降時，必須通人約50℃的空氣以維持35℃的培養(yǎng)溫度，通風量為3~5m3/m2.h。接種后20h左右可出現(xiàn)灰白色、很薄的菌膜，72h時菌膜已完全形成，菌膜相當厚且有皺褶。48h起由于菌體耗氧增加，可開動另一組風管向盤層之間通汽，進汽溫度為40℃左右，風量為7m3/m2.h，進汽濕度為75%以上，以防培養(yǎng)液水分蒸發(fā)過快。自接種后72h起進入產(chǎn)酸期，這時菌體代謝速率高，耗糖快，發(fā)酵液酸度急劇升高，并釋放出大量熱，最高時可達1000kJ/(m2.h)，此時應(yīng)加強通風措施，嚴格將發(fā)酵溫度控制在26~28℃，以利檸檬酸的形成。因此，一般在進入產(chǎn)酸期前8h左右需增大風量至15~18m3/m2.h，且降低進汽溫度在25℃以下，濕度仍在75%以上。160h以后發(fā)酵結(jié)束。
b 置換法
置換法一般是采用糖濃度低而營養(yǎng)較豐富的培養(yǎng)液先培養(yǎng)菌蓋，待菌蓋形成之后再更換發(fā)酵培養(yǎng)基�？筛鼡Q1次也可數(shù)次，發(fā)酵液用來提取檸檬酸。培養(yǎng)菌蓋，一般使用5%的糖液，視糖蜜質(zhì)量再補充少量NH4NO3、K2HPO4等鹽類。接種孢子后，室溫保持在34~36℃，培養(yǎng)液品溫為32~34℃，使孢子發(fā)芽，正常情況下40h即可形成緊密有皺的菌蓋。菌蓋形成后，放掉培養(yǎng)基，更換發(fā)酵培養(yǎng)基(即第1次置換)，并將室溫降至30~32℃，待發(fā)酵48~60h后再放掉發(fā)酵液，加入新培養(yǎng)液即進行第2次置換。如此重復(fù)，一般可置換培養(yǎng)基8~10次，總發(fā)酵周期為14~20d，收集起來的發(fā)酵液，用來提取檸檬酸。置換法的優(yōu)點是節(jié)省了大量培菌時間，發(fā)酵速度’快，而且原本不適宜長菌的原料卻可用作發(fā)酵培養(yǎng)基。但為了保持菌蓋的高活性，因此不能將發(fā)酵液殘?zhí)强刂频煤艿停@樣一來就造成替換出來的發(fā)酵液其殘?zhí)橇枯^高，給后道提取檸檬酸帶來困難。
c 不置換法影響表面發(fā)酵的因素
a) 培養(yǎng)液層厚度
培養(yǎng)基液層厚度大，發(fā)酵產(chǎn)物總的生成量就大。如果原料質(zhì)量好，預(yù)處理方法得當，曲霉菌絲體活力強，那末可適當增加液層厚度;相反，就應(yīng)減少液層厚度。
b) 糖濃度
用于表面發(fā)酵的糖蜜濃度，質(zhì)優(yōu)的糖蜜濃度(以蔗糖濃度計)為18%~22%較適宜，而質(zhì)劣的糖蜜一般采用14%。在表面發(fā)酵中，大約80%的糖被用于合成檸檬酸，菌體生長增殖耗糖8%左右，菌體進行呼吸消耗的糖在10%左右，另有1%~2%的糖用于合成副產(chǎn)物。
c) 溫度
黑曲霉適宜產(chǎn)酸溫度是26~28℃。溫度高，容易形成雜酸等副產(chǎn)物且菌體易衰老；溫度低，發(fā)酵周期被延長。
d) pH值
黑曲霉長菌的最適pH為中性，而產(chǎn)酸的最適pH在2.5~2.0。因此，應(yīng)該注意的是：菌蓋形成之后，只是在菌蓋下面有一個低PH區(qū)域，菌體合成檸檬酸的活動都是在這低pH區(qū)域內(nèi)進行的，所以不應(yīng)該攪動發(fā)液，避免低值區(qū)域的pH值上升而長菌不產(chǎn)酸。
e) 通風
表面發(fā)酵是氣相傳氧，因此傳氧效率較高，所以只要保持發(fā)酵室內(nèi)有適當空氣流通就可以滿足霉菌對氧的需要。較高度的CO2會影響菌體的生長和降低產(chǎn)酸能力。一般將CO2控制在3%以下即可。
② 固體發(fā)酵
a 淺盤發(fā)酵
將曲置于曲室內(nèi)培養(yǎng)，室溫可按需要調(diào)節(jié)。在孢子發(fā)芽和菌絲生長期，由于產(chǎn)生的熱量少，品溫會逐漸下降，在入室后自18h內(nèi)，應(yīng)維持品溫在27~31℃。培養(yǎng)18~48h期間，由于發(fā)酵熱的大量釋放，品溫上升很快，應(yīng)采取措施，不得讓品溫超過43℃，因為菌體活力下降，所以品溫會下降，此時應(yīng)維持在35℃左右，直至發(fā)酵結(jié)束。為了克服上、下曲盤的溫差，在發(fā)酵40h左右時應(yīng)將曲盤上下對調(diào)。整個發(fā)酵期間不必翻曲。曲室相對濕度在85%~90%。發(fā)酵終點根據(jù)酸度來判定，從48h開始測量酸度，以后每隔12h測定1次，自72h以后則每隔4h測定1次，在酸度達到最高時即出料，否則時間延長，檸檬酸反而被菌體消化。
b 厚層通風發(fā)酵
與淺盤發(fā)酵明顯不同的是，在物料鋪攤厚度上，厚層發(fā)酵的曲醅厚度在50cm左右，比淺盤發(fā)酵的15~20cm要大出許多。為了給曲霉菌提供氧，在培養(yǎng)過程中需要進行機械通風。培養(yǎng)過程中的溫度控制與淺盤發(fā)酵的溫度管理相似，但最高品溫不能超過40℃。溫度和濕度主要靠通風來調(diào)節(jié)，因為物料厚度大，所以培養(yǎng)過程中需要翻料。厚層發(fā)酵比淺盤發(fā)酵優(yōu)越之處在于：占地面積少，污染雜菌可能性小，機械化程度高。
3.5 蘋果酸
L-蘋果酸廣泛存在于生物體中，是生物體三羧酸循環(huán)的成員。蘋果酸廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域。因為蘋果酸具有比檸檬酸柔和的酸味，滯留時間長和口味更好的優(yōu)點，所以作為食品酸味劑更為理想。
許多微生物都能產(chǎn)生蘋果酸，但能在培養(yǎng)液中積累蘋果酸并適合于工業(yè)生產(chǎn)的，目前僅限于少數(shù)幾種，大致有：用于一步發(fā)酵法的黃曲霉、米曲霉、寄生曲霉；用于兩步發(fā)酵法的華根霉、無根根霉、短乳桿菌、膜睽畢赤酵母；用于酶轉(zhuǎn)化法的短乳桿菌、大腸桿菌、產(chǎn)氨短桿菌、黃色短桿菌。
3.5.1 一步發(fā)酵法
以糖類為發(fā)酵原料，用霉菌直接發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸的方法稱為一步發(fā)酵法。
1) 菌種
一步發(fā)酵法采用黃曲霉A-114生產(chǎn)蘋果酸。
2) 種子培養(yǎng)基組成(%)
C6H12O6 3，豆餅粉1， FeSO4 0.05，K2HPO4 0.02，NaCl 0.001，MgSO4 0.01，CaCO3 6(單獨滅菌)。
3) 種子培養(yǎng)
將保存在麥芽汁瓊脂斜面上的黃曲霉孢子用無菌水洗下并移接到裝有100ml種子培養(yǎng)基的500m1三角瓶中，在33℃下靜置培養(yǎng)2~4d，待長出大量孢子后，將其轉(zhuǎn)入到種子罐擴大培養(yǎng)，接種量為5%。種子罐的培養(yǎng)基與三角瓶培養(yǎng)基的組成相同，只是另外添加0.4%(體積分數(shù))泡敵。種子罐的裝液量為70%，罐壓0.1MPa，培養(yǎng)溫度33~34℃，通風量0.15~0.3m3/m3.min，培養(yǎng)時間18~20h。
4) 發(fā)酵培養(yǎng)基組成
C6H12O6 7%~8%，其余成分的組成及用量與種子罐培養(yǎng)基相同。
5) 發(fā)酵
發(fā)酵罐的裝液量為70%，接種量10%，罐壓0.1MPa，培養(yǎng)溫度33~34℃，通風量0.7m3/（m3.min)，攪拌轉(zhuǎn)速180r/min，發(fā)酵時間40h左右。發(fā)酵過程中由自動系統(tǒng)控制滴加泡敵，防止泡沫產(chǎn)生過多。當殘?zhí)窃?%以下時，終止發(fā)酵，產(chǎn)蘋果酸7%。
3.5.2 兩步發(fā)酵法
兩步發(fā)酵法是以糖類為原料，先由根霉菌發(fā)酵生成富馬酸(延胡索酸)和蘋果酸的混合物，然后接人酵母或細菌，將混合物中的富馬酸轉(zhuǎn)化為蘋果酸。
1) 富馬酸發(fā)酵
① 菌種
兩步發(fā)酵法以華根霉6508為菌種生產(chǎn)蘋果酸。
② 斜面培養(yǎng)
華根霉6508于葡萄糖馬鈴薯汁瓊脂斜面上，30℃培養(yǎng)7d，易于長出大量孢子。
③ 搖瓶發(fā)酵
a 培養(yǎng)基組成(%)
C6H12O6 10，(NH4)2SO4 0.5，K2HPO4 0.1，聚乙二醇10，MgSO4 0.05，F(xiàn)eCl3 0.002，CaCO3 5(單獨滅菌)。
b 富馬酸發(fā)酵
在500ml三角瓶中裝入50ml培養(yǎng)基，滅菌，冷卻。接種華根霉孢子，置往復(fù)式搖床上，于30℃下培養(yǎng)4~5d，發(fā)酵得到含富馬酸和蘋果酸的混合液。
c 轉(zhuǎn)換發(fā)酵
a) 酶轉(zhuǎn)化法
酶轉(zhuǎn)化法是國外用來生產(chǎn)L-蘋果酸的主要方法。酶轉(zhuǎn)化法是以富馬酸鹽為原料，利用微生物的富馬酸酶轉(zhuǎn)化成蘋果酸(鹽)。酶轉(zhuǎn)化法可分為游離細胞酶法、固定化細胞酶法。
b) 游離細胞酶轉(zhuǎn)化法
酶轉(zhuǎn)化方法 在pH7.5含18%富馬酸的溶液中接入2%濕菌體，于35℃、150r/min條件下轉(zhuǎn)化24~36h。轉(zhuǎn)化率達90%以上。
c) 固定化細胞酶轉(zhuǎn)化法
目前，研究得最多的是以產(chǎn)氨短桿菌或黃色短桿菌為菌種，將化學法合成的富馬酸鈉作為底物，進行固定化細胞生產(chǎn)蘋果酸。使用固定化細胞易于生成與蘋果酸難以分離的琥珀酸。因此，細胞被固定以后必須經(jīng)化學試劑處理，以防止這種副反應(yīng)的發(fā)生。采用固定化技術(shù)必須注意以下幾個問題：
細胞被固定前富馬酸酶活力要高。當富馬酸酶活力較高時，即使固定化細胞的酶活力有所下降，仍可以保證有較高的轉(zhuǎn)化力；使用的固定化方法對酶的損害較小，細胞被固定后能保持較高的酶活力；細胞被固定后不應(yīng)引起副反應(yīng)的發(fā)生；固定化細胞應(yīng)有高度的操作穩(wěn)定性；
3.5.3 蘋果酸的提取和精制
1) 從發(fā)酵醪液中提取蘋果酸
① 工藝流程
發(fā)酵液→酸解→過濾→濾液→中和→過濾→沉淀→酸解→過濾→濾液→精制→濃縮→結(jié)品→干燥→成品
② 操作方法
在發(fā)酵醪液中邊攪拌邊加入無砷硫酸，將pH值調(diào)節(jié)至1.5左右；過濾除去沉淀后，在濾液中加入碳酸鈣，直到不再有CO2放出，此時生成蘋果酸鈣；接著，用石灰乳將體系的pH值調(diào)至7.5，靜置6~8h。過濾，收集蘋果酸鈣沉淀，并用少量冷水洗去沉淀中的殘?zhí)呛推渌扇苄噪s質(zhì)；在蘋果酸鈣鹽中加入近一倍量的溫水，攪拌成懸濁液，接著加入無砷硫酸，使pH達到1.5左右，繼續(xù)攪拌30min，最后靜置數(shù)小時，使石膏渣沉淀充分析出；過濾，制得粗制蘋果酸溶液，其中含有微量富馬酸、Fe2+、Ca2+、Mg2+和色素；從聯(lián)合柱流出的高純度蘋果酸溶液，在70℃下減壓濃縮到蘋果酸濃度為65%~80%，然后冷卻至20℃，添加晶種析晶；晶體于40~50℃下真空干燥，得蘋果酸成品。
2) 從混雜富馬酸發(fā)酵醪液中提取蘋果酸
① 工藝流程
發(fā)酵廖液→濃縮→析出富馬酸結(jié)晶→過濾→濾液→濃縮→析出富馬酸結(jié)晶→過濾→濾液→冷卻，加晶種→蘋果酸結(jié)晶→干燥→成品
② 操作方法
將發(fā)酵醪液濃縮到蘋果酸濃度為50%并冷卻至20~30℃，使富馬酸結(jié)晶析出；
過濾除去富馬酸后，母液在70℃下減壓濃縮到蘋果酸濃度為65%~80%，再冷卻至20℃使富馬酸結(jié)晶再次析出。為了防止蘋果酸與富馬酸同時析出，造成蘋果酸提取收率下降，結(jié)溫度不宜低于20℃；
將過濾除去富馬酸結(jié)晶后的蘋果酸溶液冷卻至20℃，投入蘋果酸品種，緩慢攪拌，使蘋果酸結(jié)晶徐徐析出。
2) 從酶法轉(zhuǎn)化液中提取蘋果酸
從固定化細胞反應(yīng)柱中流出的酶法轉(zhuǎn)化液是清亮的，其中蘋果酸鹽含量為12.5%左右，富馬酸鹽含量為3%左右。在上述轉(zhuǎn)化液中加入硫酸，使富馬酸結(jié)晶析出，過濾后往濾液中添加碳酸鈣，使蘋果酸形成蘋果酸鈣沉淀析出。將蘋果酸鈣沉淀用硫酸酸解，酸解液經(jīng)陰離子交換樹脂處理后濃縮結(jié)晶，得蘋果酸成品。游離細胞酶法轉(zhuǎn)化液在除去細胞和其他不溶物后，按上述方法處理。