用氯化鈣制備新鮮的大腸桿菌感受態(tài)細胞

下面的簡單方案是Clhen等（1972）所用方法的變通方案，常用于成批制備感受態(tài)細菌，這些細菌可使每微克螺旋質(zhì)粒ＤＮＡ產(chǎn)生5x106-2x107個轉(zhuǎn)化菌落，這樣的轉(zhuǎn)化效率足以滿足所有在質(zhì)粒中進行的常規(guī)克隆的需要。該方法完全適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株，并且比方案Ｉ快速，重復(fù)性更好。該法制備的感受態(tài)細胞可貯存于-70℃，但保存時間過長會使轉(zhuǎn)化效率在一定程度上受到影響。
１）從于37℃培養(yǎng)16-20小時的新鮮平板中挑取一個單菌落（直徑２－３mm），轉(zhuǎn)到一個含有100ml LB或SOB培養(yǎng)基的1L燒瓶中。于37℃劇烈振搖培養(yǎng)約３小時（旋轉(zhuǎn)搖床，300轉(zhuǎn)/分）。為得到有效轉(zhuǎn)化，活細胞數(shù)不應(yīng)超過108細胞ml，可每隔20-30分種測量OD600值來監(jiān)測培養(yǎng)物的生長情況。在菌株與菌株之間，ＯＤ600值和每毫升中活細胞數(shù)間的關(guān)系變化很大，因此有必要通過測量特定大腸桿菌菌株的生長增減物在生長周期的不同時相的ＯＤ600值，并將各黧度的增減物鋪于無抗生素的ＬＢ瓊脂平皿以計算每一時相的活細胞數(shù)，從而使分光光度讀數(shù)得到標化。
２）在無菌條件下將細菌轉(zhuǎn)移到一個無菌、一次性使用的、用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯管（Falcon 2070）中，在冰上放置10分鐘，使培養(yǎng)物冷卻至０℃。切記：下述所有步驟均需無菌操作。
３）于４℃用Sorvall GS3轉(zhuǎn)頭（或與其相當?shù)霓D(zhuǎn)頭）以4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，以回收細胞。
４）倒出培養(yǎng)液，將管倒置１分釧以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。
５）以10ml用冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2重懸每份沉淀，放置于冰浴上。我們發(fā)現(xiàn)將１mol/L CaCl2貯存液[用純水（Ｍille-Q級或與其相當?shù)募墑e）配制]以10ml小份貯存于-20℃煞是方便。制備感受態(tài)細胞時，取一小份融化，用純水稀釋至100mlk，用Nalgene濾器（0.45μm孔徑）過濾除菌，然后驟冷到０℃即可。對于大多數(shù)大腸肝菌菌株（除ＭＣ1061外），在這一步采用TFB（見表1.3）代替氯化鈣可得到相同的或更好的結(jié)果。
６）于４℃以4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，以回收細胞。
７）倒出培養(yǎng)液，將管倒置１分鐘以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。
８）每50ml初始培養(yǎng)物用2ml用冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2[或ＴＦＢ，見表1.3和步驟５）注]重懸每份細胞沉淀。此時，可將細胞分成小份，放于-70℃凍存[有關(guān)討論請參見53頁本節(jié)（二）步驟11)b.c)]。在這些條件下，盡管長期保存后轉(zhuǎn)化效率會稍有下降，但細胞仍可保持處于感受態(tài)。Dagert和Ehrlich(1979)曾表明細胞可以于４℃在CaCl2溶液中保存24-48小時，在貯存的最初12-24小時內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率增加３－５倍，然后降低到初始水平。
９）用冷卻的無菌吸頭從每種感受態(tài)細胞懸液中各取200μl轉(zhuǎn)移到無菌的微量離心管中，每管加ＤＮＡ（體積∞10μl,ＤＮＡ∞50ng），輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30分鐘。
10）將管放到預(yù)加溫到42℃的循環(huán)水浴中放好的試管回上，恰恰放置90秒，不要搖動試管。
11）快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細胞冷卻１－２分鐘。
12）每管加800μlＳＯＣ培養(yǎng)基（見附錄Ａ）。用水溶將培養(yǎng)基加溫至37℃，然后將管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上，溫育45分鐘細菌復(fù)蘇，并且表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標記基因。如果要求更高的轉(zhuǎn)化效率，在復(fù)蘇期中，應(yīng)溫和地搖動細胞（轉(zhuǎn)速不超過225轉(zhuǎn)/分）。
13）將適當體積（每個90mm平板可達200μl）已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)移到含20mmol/L MgSO4和相應(yīng)抗生素的ＳＯＢ瓊脂培養(yǎng)基上。如培養(yǎng)物體積太�。ā�10μl）�？稍偌尤鉁�培養(yǎng)基，用一無菌的彎頭玻棒輕輕地將轉(zhuǎn)化的細胞涂到瓊脂平板表面。如在一個90mm平板上鋪200μl以上的感受態(tài)細胞，應(yīng)離心濃縮細胞，然后用適量ＳＯＣ輕輕重懸細胞。如用四環(huán)素抗性作為選擇標記，全部的轉(zhuǎn)化混合物可以鋪在一個單獨的平皿上（或鋪在軟瓊脂中）。然而如選用氨芐青霉素抗性，則只能將一部分培養(yǎng)物（根據(jù)實驗決定）鋪在單獨的平皿上。氨芐青霉素抗性功的增加與平皿上所加細菌數(shù)的增加并無線性比例關(guān)系，這可能是因為被抗生素殺死的細胞可釋放生長掏物質(zhì)的緣故。
14）將平板置于室溫直至液體被吸收。
15）倒置平皿，于37℃培養(yǎng)，12-16小時后可出現(xiàn)菌落。如檢查氨芐青霉素抗性，用轉(zhuǎn)化細胞鋪增板時密度較低（每個90mm平板不超過104菌落），于37℃培養(yǎng)平板時不應(yīng)超過20小時。氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化可將β－內(nèi)酰胺酶分泌到培養(yǎng)基中，迅速滅活菌落周圍區(qū)域中的抗生素。這樣，鋪平板時密度太高或培養(yǎng)時間太長都會導(dǎo)致出現(xiàn)對氨芐青霉素敏感的衛(wèi)星菌落。在選擇培養(yǎng)基中不用氨芐青霉素而改用羧芐青霉素，以及將抗生素濃度從60μg/ml增至100μg/ml，可使情況有所改善，但不能徹底根除之。