Ⅰ、將經(jīng)熒光標(biāo)記的抗體進(jìn)行稀釋。如果濃度過(guò)高，背景會(huì)因?yàn)榈姆翘禺愋缘南嗷プ饔玫脑黾佣黾印?/p>
Ⅱ、在使用第一抗體之前，將樣品與過(guò)量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脫脂干奶酪，或來(lái)自于同一寄主的正常血清來(lái)作為標(biāo)記的第二抗體。這個(gè)步驟通過(guò)阻斷第一抗體和細(xì)胞表面或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的非特異性的交互作用來(lái)降低背景。
Ⅲ、在使用第一抗體之后，將樣品與5%至10%的來(lái)自于同一寄主的正常血清作為標(biāo)記的第二抗體一起培育。這個(gè)步驟會(huì)減少不必要的第二抗體與第一抗體、細(xì)胞表面或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)之間的交互作用。
通過(guò)用來(lái)自于同樣的樣品的血清稀釋標(biāo)記過(guò)的抗體可以略過(guò)此步驟。此步驟適用于很多方面，但有時(shí)候它也會(huì)導(dǎo)致已標(biāo)記的第二抗體和正常血清中的免疫球蛋白的免疫復(fù)合體的形成。這種復(fù)合體會(huì)優(yōu)先與一些細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)合，或者它們最終會(huì)導(dǎo)致期望得到的抗體活性的丟失。
Ⅳ、使用F(ab’)2片段會(huì)使背景決定于第一或第二抗體與FC受體的全分子結(jié)合。大多數(shù)的第二抗體的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗體的F(ab’)2片段一般是不能利用或很難制作。因此，在NaN3存在的條件下，將新鮮組織或細(xì)胞與正常血清一起培育應(yīng)選擇優(yōu)先加入第一抗體。在此情況下，即使在隨后的步驟中用完所有的抗體分子，F(xiàn)C受體決定的背景影響已不再重要。
Ⅴ、在預(yù)料不到的已標(biāo)記的抗體和其他一些內(nèi)在的免疫球蛋白或加入實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中的物質(zhì)的交叉反應(yīng)會(huì)引起背景影響。為了降低背景，在多重標(biāo)記過(guò)程中，所有的已標(biāo)記的抗體應(yīng)被吸附，避免其他種類(lèi)蛋白的交叉反應(yīng)以減少與這些從流式培養(yǎng)中產(chǎn)生的免疫球蛋白的結(jié)合。這些種類(lèi)的蛋白存在于細(xì)胞表面或組織中，或額外加入的作為第一抗體和其他第二抗體的蛋白。交在多重標(biāo)記過(guò)程中，通過(guò)使用來(lái)源于一個(gè)單個(gè)寄主個(gè)體的已標(biāo)記抗體，多功能第一抗體和第二抗體的交叉反應(yīng)也可以被吸附，以避免和其他寄主個(gè)體進(jìn)行交叉反應(yīng)來(lái)減少背景影響。