免疫血清的制備是一項(xiàng)常用的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。高效價(jià)、高特異性的免疫血清可作為免疫學(xué)診斷的試劑(如用于制備免疫標(biāo)記抗體等)，也可供特異性免疫治療用。免疫血清的效價(jià)高低取決于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫反應(yīng)性及抗原的免疫原性。如以免疫原性強(qiáng)的抗原刺激高應(yīng)答性的機(jī)體，�？色@得高效價(jià)的免疫血清。而使用免疫原性弱的抗原免疫時(shí)，則需同時(shí)加用佐劑以增強(qiáng)抗原的免疫原性。免疫血清的特異性主要取決于免疫用抗原的純度。因此，如欲獲得高特異性的免疫血清，必須予先純化抗原。此外，抗原的劑量、免疫途徑及注射抗原的時(shí)間間隔等，也是影響免疫血清效價(jià)的重要因素應(yīng)予重視。
一、原理
具有免疫原性的抗原可刺激機(jī)體相應(yīng)B細(xì)胞增殖、分化形成漿細(xì)胞并分泌特異性抗體。由于抗原分子表面的不同決定簇為不同特異性的B細(xì)胞克隆所識(shí)別，因此由某一抗原刺激機(jī)體后產(chǎn)生的抗體，實(shí)際上為針對(duì)該抗原分子表面不同決定簇的抗體混合物(即多克隆抗體)。另外，抗體的產(chǎn)生具有回憶應(yīng)答的規(guī)律性，牨m現(xiàn)為初次免疫注射與再次免疫注射后的抗體應(yīng)答特點(diǎn)截然不同。這是由于記憶性B細(xì)胞參與再次應(yīng)答所致。
二、免疫方法
根據(jù)抗原的性質(zhì)不同而異。下面以制備家兔抗人IgG免疫血清為例作具體說(shuō)明。
1.用剪刀剪去家兔兩后腳掌的部分兔毛，以酒精及碘酒消毒皮膚；
2.第一次免疫: 用2ml注射器吸取弗氏完全佐劑(FCA)乳化的抗原(人IgG)下稱FCA-IgG)液1ml，每側(cè)腳掌皮下各注入0.5ml。
3.第二次免疫：間隔10-14天后，于兩側(cè) 窩及鼠蹊部腫大的淋巴結(jié)內(nèi)注入FCA-IgG，每個(gè)淋巴結(jié)注0.1ml，其余注入淋巴結(jié)附近皮下共1ml。如淋巴結(jié)未腫大或腫大不明顯時(shí)，直接注入兩側(cè) 窩及鼠蹊部皮下。
4.間隔7-10天后，從耳靜脈采血0.5～1.0ml，分離血清，以雙相瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定免疫血清的抗體效價(jià)(即試血)。效價(jià)至少應(yīng)達(dá)到1∶16以上時(shí)才能放血。
5.若效價(jià)未達(dá)到要求，可用不加佐劑的抗原液(人IgG)耳靜脈內(nèi)注射免疫。即于1周內(nèi)注射3次，分別為0.1、0.3、0.5ml。間隔1周再試血。如效價(jià)達(dá)到要求應(yīng)立即放血。另外,也可在第2次免疫后，以弗氏不完全佐劑(FIA)乳化的抗原(人IgG)(簡(jiǎn)稱FIA-IgG)再免疫1-2次。注射部位、劑量和間隔均同第2次，再試血測(cè)抗體效價(jià)，如效價(jià)達(dá)到要求立即放血。
三、放血
(一)心臟采用血法
1.家兔仰面，四肢縛于動(dòng)物固定架上(或由助手抓住四肢固定)；
2.剪去左胸部兔毛，消毒皮膚；
3.用左姆指摸到胸骨劍突處，食指及中指放在右胸處輕輕向左推心臟，并使心臟固定于左胸側(cè)位置。然后，以左拇指觸摸心臟搏動(dòng)最強(qiáng)的部位；
4.用50ml注射器(連接16號(hào)針頭)，傾針45°角度，對(duì)準(zhǔn)心搏最強(qiáng)處刺入心臟抽血致死；
5.將抽取的血液立即注入無(wú)菌三角燒瓶中，待凝固后分離血清。
(二)頸動(dòng)脈放血法
1.家兔仰臥同上固定。頭部略放低以暴露頸部。剃毛及消毒皮膚；
2.沿頸部中線切開(kāi)皮膚約10cm，分離皮下組織，直至暴露出氣管兩側(cè)的胸鎖乳突肌；
3.分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區(qū)疏松組織，暴露出頸總動(dòng)脈后使之游離；
4.于動(dòng)脈下套入兩根黑絲線，分別置于遠(yuǎn)心及近心端。結(jié)扎遠(yuǎn)心端的絲線。近心端的動(dòng)脈用血管夾夾��；
5.用尖頭小剪刀在兩根絲線間的動(dòng)脈璧上剪一小口，插入塑料放血管。再將近心端的絲線結(jié)扎固定于放血管上，以防放血管滑脫；
6.松開(kāi)血管夾，使血液流入滅菌三角燒瓶中。一般一只家兔可放血80～100ml。
四、分離血清
將三角燒瓶的血置37℃溫箱1小時(shí)，再置4℃冰箱內(nèi)3～4小時(shí)。待血液凝固血塊收縮后，用毛細(xì)滴管吸取血清。于3000rpm離心15分鐘，取上清加入防腐劑(0.01％硫柳汞或0.02％疊氮鈉，最終濃度)，分裝后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br />五、結(jié)果鑒定
以雙相瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定所獲免疫血清的抗體效價(jià)，并用瓊指免疫電泳鑒定免疫血清中抗體的質(zhì)量，應(yīng)產(chǎn)生單一的沉淀弧線。鑒定方法的具體步驟參見(jiàn)有關(guān)部分。
六、材料
(一) 動(dòng)物：健康成年家兔，雄性，體重2～3公斤。
(二) 器材：剪刀、鑷子、注射器(2ml、50ml)附針頭(9號(hào)、6號(hào))、稱量瓶(10ml)、量筒、動(dòng)物固定架、滅菌三角燒瓶(200ml)、手術(shù)器械一套、血管夾、黑絲線、塑料放血管等。
(三) 試劑
1.滅菌生理鹽水；
2.純化人IgG(10mg／ml)；
3.消毒酒精及碘酒；
4.羊毛脂；
5.石蠟油；
6.活卡價(jià)苗(BCG)(75mg／ml)；
7.弗氏不完全佐劑(FIA)制備：稱羊毛脂10克，逐滴加入優(yōu)質(zhì)石蠟油40ml，邊滴邊研磨，分裝于疫苗瓶中(每瓶10ml)，高壓滅菌(8磅20分鐘)后保存?zhèn)溆谩?br />8.弗氏完全佐劑乳化抗原(FCA-IgG)的制備：將FIA予溫(60℃30分鐘)，吸取3ml于研缽中，逐滴加入活BCG(75mg／ml)0.5ml及純化人IgG2.5ml(2.4mg／ml)牨_滴入邊研磨直至形成均一性的乳狀液，取1滴滴于冷水面上不散開(kāi)為合格。
七、注意事項(xiàng)
1.免疫用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的抗體反應(yīng)性個(gè)體差異性較大，因此免疫時(shí)至少應(yīng)選用兩只以上動(dòng)物。另外，不能使用妊娠動(dòng)物。
2.免疫用的抗原必須經(jīng)FCA或FIA充分乳化后才能注射，否則將明顯影響抗原的免疫效果。上述制備乳化抗原的方法較費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。采用H-81微型振蕩混合器法或三腔管研磨法制備。前者是將抗原液與佐劑按比例混合后，置于混合器上使之劇烈振蕩(頻率2900轉(zhuǎn)／分，振幅6mm)；后者是將免疫用的佐劑和抗原液按比例混合后，吸入注射器內(nèi)再將注射器連接于三腔管上反復(fù)抽吸研磨。這兩種方法約1小時(shí)即可使抗原充分乳化。
3.佐劑一方面可提高特異性免疫反應(yīng)的效果獲得高效價(jià)的免疫血清，但若抗原不純時(shí)，可使抗原中極微量的污染物(0.005mgN)產(chǎn)生抗體，以致導(dǎo)致免疫血清的純度受到影響。另外，有些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種系對(duì)BCG過(guò)敏，尤其是豚鼠其次是家兔，當(dāng)再次注射完全佐劑時(shí),可以引起變態(tài)反應(yīng)而導(dǎo)致免疫失敗。為此，第二次免疫注射時(shí)應(yīng)減少佐劑中BCG的含量或改用不完全佐劑，以減少和防止變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生。
4.抗原的劑量決定于抗原的種類(lèi)。對(duì)免疫原性強(qiáng)的抗原劑量應(yīng)相別較少，免疫原性弱的抗原劑量可相對(duì)較多�？乖挠昧恳话阋泽w重計(jì)算。在使用佐劑的情況下，一次注入的總劑量以0.5mg／kg體重為宜。如不加佐劑時(shí)劑量可加大10倍。另外，免疫周期長(zhǎng)者可少量多次注射，免疫周期短者可較大量少次注射。
5.免疫方法上也可采用多點(diǎn)注射法免疫動(dòng)物。即于家兔脊柱兩旁選4-6點(diǎn)皮下注射，同時(shí)于兩側(cè)肩部(或臂部)和鼠蹊部各注一處。每點(diǎn)注0.2ml，間隔2周后再于上述部位選不同點(diǎn)同上注射，也可產(chǎn)生高效價(jià)的免疫血清。
一、原理
具有免疫原性的抗原可刺激機(jī)體相應(yīng)B細(xì)胞增殖、分化形成漿細(xì)胞并分泌特異性抗體。由于抗原分子表面的不同決定簇為不同特異性的B細(xì)胞克隆所識(shí)別，因此由某一抗原刺激機(jī)體后產(chǎn)生的抗體，實(shí)際上為針對(duì)該抗原分子表面不同決定簇的抗體混合物(即多克隆抗體)。另外，抗體的產(chǎn)生具有回憶應(yīng)答的規(guī)律性，牨m現(xiàn)為初次免疫注射與再次免疫注射后的抗體應(yīng)答特點(diǎn)截然不同。這是由于記憶性B細(xì)胞參與再次應(yīng)答所致。
二、免疫方法
根據(jù)抗原的性質(zhì)不同而異。下面以制備家兔抗人IgG免疫血清為例作具體說(shuō)明。
1.用剪刀剪去家兔兩后腳掌的部分兔毛，以酒精及碘酒消毒皮膚；
2.第一次免疫: 用2ml注射器吸取弗氏完全佐劑(FCA)乳化的抗原(人IgG)下稱FCA-IgG)液1ml，每側(cè)腳掌皮下各注入0.5ml。
3.第二次免疫：間隔10-14天后，于兩側(cè) 窩及鼠蹊部腫大的淋巴結(jié)內(nèi)注入FCA-IgG，每個(gè)淋巴結(jié)注0.1ml，其余注入淋巴結(jié)附近皮下共1ml。如淋巴結(jié)未腫大或腫大不明顯時(shí)，直接注入兩側(cè) 窩及鼠蹊部皮下。
4.間隔7-10天后，從耳靜脈采血0.5～1.0ml，分離血清，以雙相瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定免疫血清的抗體效價(jià)(即試血)。效價(jià)至少應(yīng)達(dá)到1∶16以上時(shí)才能放血。
5.若效價(jià)未達(dá)到要求，可用不加佐劑的抗原液(人IgG)耳靜脈內(nèi)注射免疫。即于1周內(nèi)注射3次，分別為0.1、0.3、0.5ml。間隔1周再試血。如效價(jià)達(dá)到要求應(yīng)立即放血。另外,也可在第2次免疫后，以弗氏不完全佐劑(FIA)乳化的抗原(人IgG)(簡(jiǎn)稱FIA-IgG)再免疫1-2次。注射部位、劑量和間隔均同第2次，再試血測(cè)抗體效價(jià)，如效價(jià)達(dá)到要求立即放血。
三、放血
(一)心臟采用血法
1.家兔仰面，四肢縛于動(dòng)物固定架上(或由助手抓住四肢固定)；
2.剪去左胸部兔毛，消毒皮膚；
3.用左姆指摸到胸骨劍突處，食指及中指放在右胸處輕輕向左推心臟，并使心臟固定于左胸側(cè)位置。然后，以左拇指觸摸心臟搏動(dòng)最強(qiáng)的部位；
4.用50ml注射器(連接16號(hào)針頭)，傾針45°角度，對(duì)準(zhǔn)心搏最強(qiáng)處刺入心臟抽血致死；
5.將抽取的血液立即注入無(wú)菌三角燒瓶中，待凝固后分離血清。
(二)頸動(dòng)脈放血法
1.家兔仰臥同上固定。頭部略放低以暴露頸部。剃毛及消毒皮膚；
2.沿頸部中線切開(kāi)皮膚約10cm，分離皮下組織，直至暴露出氣管兩側(cè)的胸鎖乳突肌；
3.分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區(qū)疏松組織，暴露出頸總動(dòng)脈后使之游離；
4.于動(dòng)脈下套入兩根黑絲線，分別置于遠(yuǎn)心及近心端。結(jié)扎遠(yuǎn)心端的絲線。近心端的動(dòng)脈用血管夾夾��；
5.用尖頭小剪刀在兩根絲線間的動(dòng)脈璧上剪一小口，插入塑料放血管。再將近心端的絲線結(jié)扎固定于放血管上，以防放血管滑脫；
6.松開(kāi)血管夾，使血液流入滅菌三角燒瓶中。一般一只家兔可放血80～100ml。
四、分離血清
將三角燒瓶的血置37℃溫箱1小時(shí)，再置4℃冰箱內(nèi)3～4小時(shí)。待血液凝固血塊收縮后，用毛細(xì)滴管吸取血清。于3000rpm離心15分鐘，取上清加入防腐劑(0.01％硫柳汞或0.02％疊氮鈉，最終濃度)，分裝后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br />五、結(jié)果鑒定
以雙相瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定所獲免疫血清的抗體效價(jià)，并用瓊指免疫電泳鑒定免疫血清中抗體的質(zhì)量，應(yīng)產(chǎn)生單一的沉淀弧線。鑒定方法的具體步驟參見(jiàn)有關(guān)部分。
六、材料
(一) 動(dòng)物：健康成年家兔，雄性，體重2～3公斤。
(二) 器材：剪刀、鑷子、注射器(2ml、50ml)附針頭(9號(hào)、6號(hào))、稱量瓶(10ml)、量筒、動(dòng)物固定架、滅菌三角燒瓶(200ml)、手術(shù)器械一套、血管夾、黑絲線、塑料放血管等。
(三) 試劑
1.滅菌生理鹽水；
2.純化人IgG(10mg／ml)；
3.消毒酒精及碘酒；
4.羊毛脂；
5.石蠟油；
6.活卡價(jià)苗(BCG)(75mg／ml)；
7.弗氏不完全佐劑(FIA)制備：稱羊毛脂10克，逐滴加入優(yōu)質(zhì)石蠟油40ml，邊滴邊研磨，分裝于疫苗瓶中(每瓶10ml)，高壓滅菌(8磅20分鐘)后保存?zhèn)溆谩?br />8.弗氏完全佐劑乳化抗原(FCA-IgG)的制備：將FIA予溫(60℃30分鐘)，吸取3ml于研缽中，逐滴加入活BCG(75mg／ml)0.5ml及純化人IgG2.5ml(2.4mg／ml)牨_滴入邊研磨直至形成均一性的乳狀液，取1滴滴于冷水面上不散開(kāi)為合格。
七、注意事項(xiàng)
1.免疫用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的抗體反應(yīng)性個(gè)體差異性較大，因此免疫時(shí)至少應(yīng)選用兩只以上動(dòng)物。另外，不能使用妊娠動(dòng)物。
2.免疫用的抗原必須經(jīng)FCA或FIA充分乳化后才能注射，否則將明顯影響抗原的免疫效果。上述制備乳化抗原的方法較費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。采用H-81微型振蕩混合器法或三腔管研磨法制備。前者是將抗原液與佐劑按比例混合后，置于混合器上使之劇烈振蕩(頻率2900轉(zhuǎn)／分，振幅6mm)；后者是將免疫用的佐劑和抗原液按比例混合后，吸入注射器內(nèi)再將注射器連接于三腔管上反復(fù)抽吸研磨。這兩種方法約1小時(shí)即可使抗原充分乳化。
3.佐劑一方面可提高特異性免疫反應(yīng)的效果獲得高效價(jià)的免疫血清，但若抗原不純時(shí)，可使抗原中極微量的污染物(0.005mgN)產(chǎn)生抗體，以致導(dǎo)致免疫血清的純度受到影響。另外，有些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種系對(duì)BCG過(guò)敏，尤其是豚鼠其次是家兔，當(dāng)再次注射完全佐劑時(shí),可以引起變態(tài)反應(yīng)而導(dǎo)致免疫失敗。為此，第二次免疫注射時(shí)應(yīng)減少佐劑中BCG的含量或改用不完全佐劑，以減少和防止變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生。
4.抗原的劑量決定于抗原的種類(lèi)。對(duì)免疫原性強(qiáng)的抗原劑量應(yīng)相別較少，免疫原性弱的抗原劑量可相對(duì)較多�？乖挠昧恳话阋泽w重計(jì)算。在使用佐劑的情況下，一次注入的總劑量以0.5mg／kg體重為宜。如不加佐劑時(shí)劑量可加大10倍。另外，免疫周期長(zhǎng)者可少量多次注射，免疫周期短者可較大量少次注射。
5.免疫方法上也可采用多點(diǎn)注射法免疫動(dòng)物。即于家兔脊柱兩旁選4-6點(diǎn)皮下注射，同時(shí)于兩側(cè)肩部(或臂部)和鼠蹊部各注一處。每點(diǎn)注0.2ml，間隔2周后再于上述部位選不同點(diǎn)同上注射，也可產(chǎn)生高效價(jià)的免疫血清。