(一) 原理
目前用于抗體標(biāo)記的熒光素主要有異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocynate,FITC)或羅達(dá)明(Lissamine rhodamine B200, RB200)。在鹼性條件下FITC的碳酰胺鍵可與抗體賴氨酸的ε氨基共價結(jié)合，標(biāo)記后的抗體仍保持與相應(yīng)抗原結(jié)合的能力。在熒光燈源紫外線或蘭紫光激發(fā)下產(chǎn)生黃綠色熒光，通過在熒光顯微鏡下觀察或流式細(xì)胞儀分析可對相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位或定量的檢測。
(二) 操作步驟
將純化的IgG抗體對PH9～9.5碳酸鹽緩沖液透析過夜，
透析后抗體液移入小燒杯中
↓
稱取適量IFTC，加入二甲亞砜(DMSO)(FITC～1mg/1ml DMSO)
使終濃度為1mgFITC／1mlDMSO
FITC／IgG比例:如IgG濃度為1mg／ml，F(xiàn)ITC／IgG比例約為50μgFITC／mgIgG；
如IgG為5～10mg／ml，則比例為25μgFITC／ml IgG
在10ml小燒杯中先放入抗體
↓
按上述比例將FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗體溶液中
↓
將標(biāo)記物用PBS加至2.5ml，磁力攪拌器室溫下避光攪拌2h
↓
用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游離熒光素，先用25ml PBS淋洗G25柱
↓
收集PBS洗脫第一個熒光素結(jié)合蛋白峰，測定F／P
比值。第二個熒光素峰為游離熒光素
計算:
2.87×A495
F／P＝────────
A280-0.35×A495
合適的F／P值為2～4。
(三) 試劑器材
1. 純化的多克隆抗體或單克隆抗體。
2. FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它熒光色素。
3. PBS、DMSO
4. PH9～9.5碳酸鹽緩沖液: Na2CO34.3g，NaHCO3 8.6g加蒸餾水至500ml。
5. PD10柱(Sephadex G25柱)
6. 磁力攪拌器，紫外分光光度計等
(四) 注意事項
1. FITC保存于4℃暗處，使用前待試劑瓶升至室溫時開蓋稱取，以避免潮解。
2. FITC-DMSO液要臨用時配制。
3. 碳酸鹽緩沖液要新鮮配制。