免疫電泳（Immunoelectrophoresis）

原理

蛋白質是一種兩性電解質,它同時具有游離氨基和羧基。每種蛋白質都有它自己的等電點。等電點的高低取決于蛋白質的性質，在等電點時，蛋白質所帶的正負電荷相等。在pH大于等電點溶液中，羧基解離多，此時蛋白質帶負電荷，帶負電荷的蛋白質在電場中向正極移動。反之，在pH小于等電點的溶液中，氨基解離多，此時蛋白質帶正電荷，在電場中向負極移動。

這種帶電質點在電場中向著帶異相電荷的電場移動，稱為電泳。帶電質點所以能在電場中移動以及具有一定的移動速度，取決于其本身所帶的電荷、電場強度、溶液的pH值、粘度以及電滲等因素。

影響電泳的因素

不同帶電質點在同一電場中的遷移率（或泳動度）不同，影響遷移率的因素有：①帶電質點的性質：即顆粒所帶凈電荷的量，顆粒大小及形狀等。帶電荷越多，分子越小，泳動速度越快；②電場強度：電場強度是單位厘米的電位差。電場強度越大，帶電質點泳動速度越快。反之亦然；③溶液中pH值：溶液的pH值決定了帶電質點的解離程度，也決定了物質所帶電荷的多少。對蛋白質、氨基酸等兩性電解質而言，pH值離等電點越遠，顆粒所帶的電荷越多，電泳速度也越快。反之則越慢。蛋白質在酸性溶液中易變性，在偏堿溶液中比較穩(wěn)定，所以蛋白質電泳大多用pH8.2～8.8的巴比妥或硼酸緩沖液，在這種pH中，血清蛋白一般都帶負電荷；④溶液的離子強度：溶液的離子強度越高，顆粒泳動速度越慢，反之越快。血清電泳一般最適宜離子強度在0.025～0.075之間。離子強度越低，緩沖液的電流下降，擴散現(xiàn)象嚴重，使分辨力明顯降低。離子強度太高，將有大量的電流通過瓊脂板，由此而產(chǎn)生的熱量使板中水分大量蒸發(fā)，嚴重時可使瓊脂板斷裂而導致電泳中斷。溶液中離子強度與溶液的濃度成正比。μ=1/2∑CZ²(μ為離子強度，C為克分子濃度，Z為離子的價數(shù))；⑤電滲作用：電滲是在電場中液體對于固體支持物的相對移動。由于瓊脂中含有SO₄^2-，帶負電荷，造成靜電感應致使附近的水帶正電荷，而向負極移動，所以電泳時有兩種力，即電泳力和電滲力。如果物質原來帶正電荷，向負極移動，則因電滲作用向負極移動得更快。如果物質向正極移動，所帶電荷少，電泳力抵不過電滲力，則也向負極移動，血清中的γ球蛋白就是如此；⑥吸附作用：即介質對樣品的滯留作用。它導致了樣品的拖尾現(xiàn)象而降低了分辨率。紙的吸附作用最大，醋酸纖維膜的吸附作用較小或無；⑦電泳時間：電泳時間與遷移率成正比。

電泳中常用儀器

1．電泳儀

2．電泳槽 一般采用閉合式，即為了防止在電泳過程中產(chǎn)熱，而使瓊脂凝膠水分過度蒸發(fā)的設施。作電極用的鉑金絲必須與電泳槽等長，這樣電場才能均勻。電泳槽容量不宜過小，以防止溶液的濃度、pH值或離子強度發(fā)生改變，影響電泳條件的恒定性。

瓊脂的選擇和制備

電泳是利用一種支撐物作為一種介質讓帶電粒子通過，而其本身不發(fā)生變化。支撐物一般是采用瓊脂或瓊脂糖、纖維素膜、濾紙以及聚丙烯酰胺凝膠等。

1．支撐物的條件

⑴惰性物質，電泳后本身不發(fā)生變化。

⑵制成凝膠后，其分子排列均勻，孔徑大小一致便于帶電質體自由通過。

⑶透明、無雜質、電滲作用小，并且有一定的粘度與脆性。

⑷價格便宜。

一般多用瓊脂粉或瓊脂糖。瓊脂糖是瓊脂粉進一步提煉而成，很少或幾乎無電滲作用。

2．凝膠板的制備 稱取所需要量的瓊脂粉，加入緩沖液（瓊脂濃度一般1%～2％，瓊脂糖0.75%～1.5％），同時加萬分之一的硫柳汞防腐。水浴煮沸，待瓊脂完全溶化后，液體清涼，再煮一段時間。選擇適當大小的、無油膩、無劃痕的干凈玻璃板，根據(jù)所需的厚度（一般為2mm～4mm厚），計算好瓊脂的用量。把玻片置于事先用水準儀測試的平臺上，倒入熔化的瓊脂，注意不要產(chǎn)生氣泡。冷卻后，按事先制好的圖形大孔，用點水筆尖挑去孔內的瓊脂，在火焰下輕烤以封底，以防止樣品從瓊脂底部泳過。然后加樣，不用的瓊脂板，放入冰箱中，注意防止干涸和冰凍。

緩沖液的選擇與配制

常用的電泳緩沖液有以下兩種。

1． pH8.6離子強度0.025Mol/L～0.075Mol/L的巴比妥緩沖液，配制方法如表：

表 巴比妥緩沖液配制

2．pH8.6硼酸緩沖液，離子強度0.05Mol/L

硼酸 6.70g

硼砂（Na₂B₄O₇·10H₂O） 13.40g

H₂O 加至 1 000ml

緩沖液配制后，加萬分之一的硫柳汞防腐。兩側電泳槽加緩沖液至2／3～4／5的槽體積，注意兩側一樣多，以免造成液面差，產(chǎn)生虹吸作用，影響電泳。

當?shù)鞍踪|泳動至槽內后，就應該更換緩沖液。有人認為長久電泳過的電泳液易于把血清中各成分分開，而新配制的則差一些。為了防止緩沖液離子強度的改變，可以在每次電泳時更換正負極（這是目前廣泛采用的）；也可以在下一次電泳前，將兩槽內的緩沖液混合后再用。但也有人認為不能混合再用，必須更新。

電場強度的顯示

以V／cm長或I／cm寬表示。電壓的測量必須用電壓表測量凝膠板兩端的電壓差，再除以板長，而不能以電泳儀上的電壓數(shù)表示，當然這兩者有一定的相關性。電泳儀上的電流強度除以凝膠板寬即可代表電場強度。在實際工作中，很難有兩項指標都符合的調控，因此只能根據(jù)取其一個指標進行調控，一般多按電流計算。

結果觀察與標本的保存

對于與免疫有關的電泳，一般能形成明顯的抗原抗體復合物，因此可以直接觀察。也可以染色觀察。染色后同時也起到了保存標本的作用。具體步驟如下：

1．將瓊脂板放入生理鹽水中4℃浸泡2天～3天，每天換液數(shù)次，以洗去多余的蛋白質。

2．染色 將洗好的瓊脂板放入氨基黑或偶氮胭脂紅染色液中染色15min～30min。

0.5％氨基黑染色液的配制：

氨基黑4B（10B也可） 0.50g

甲醇 5ml

冰醋酸 10ml

H₂O 40ml

0.75％偶氮胭脂紅染色液的配制：

偶氮胭脂紅 1.50g

甲醇 100ml

冰醋酸 20ml

H₂O 80ml

先將染料放入研缽中，邊研磨邊加甲醇，使染料充分溶解，再加冰醋酸，最后加蒸餾水，以濾紙過濾，置棕色瓶保存。

3．脫色 染色后，將瓊脂板放入脫色液中脫色，至瓊脂板底色脫凈為止，脫色液要勤換。

脫色液的配制：

乙醇 45ml

冰醋酸 5ml

H₂O 50ml

脫色液用過后，可用活性炭吸附染色顆粒，過濾后，可再使用。

4．漂洗 用蒸餾水漂洗。

5．制膜 把瓊脂膠滑到玻璃紙上，下墊一玻璃塊，展平玻璃紙。在瓊脂表面上抹一層甘油（以防干裂），放37℃溫箱烘干即可。也可以先制膜后染色。

對于非免疫性電泳標本的染色基本同于免疫電泳。但不要進行漂洗，電泳后直接投入染色液中或固定后投入染色液中。

6．標本的保存 主要是染色后拍照保存，也可制膜保存。

電泳的分類

1．根據(jù)支撐物的不同可分為：

⑴凝膠電泳：如瓊脂電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。

⑵紙或纖維素膜電泳：如濾紙電泳、醋酸纖維膜電泳、硝酸纖維素膜電泳等。

⑶粉末電泳：如淀粉、纖維素粉電泳等。

2．根據(jù)電場強度的不同可分為：

⑴低壓電泳：電場強度1V/cm～5V/cm，電泳時間較長，可數(shù)小時至十幾小時。

⑵中壓電泳：電場強度5V/cm～20V/cm，電泳時間一般數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘。

⑶高壓電泳：電場強度20V/cm～200V/cm，電泳時間短，一般為數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘。

3．根據(jù)離子強度的不同而分為：

⑴連續(xù)電泳：是指電泳槽緩沖液的類型與離子強度和玻璃板上支撐物的一致。

⑵非連續(xù)電泳：使電泳槽內緩沖液的類型與離子強度和玻璃板上支撐物的不一致。一般常采用瓊脂板的離子強度為電泳槽的一半。

4．根據(jù)電泳的目的可分為：區(qū)帶電泳、免疫電泳 胞電泳等

5．根據(jù)形狀可分為火箭電泳、圓盤電泳等。