基本原理
玫瑰花環(huán)試驗(yàn)是體外檢測人和動(dòng)物細(xì)胞免疫功能的一種方法。E—玫瑰花環(huán)試驗(yàn)是T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的一種重要方法。由于人和動(dòng)物的T淋巴細(xì)胞表面有紅細(xì)胞受體，因此紅細(xì)胞可以粘附到T淋巴細(xì)胞的周圍而形成玫瑰花樣的細(xì)胞團(tuán)。在紅細(xì)胞中，以綿羊紅細(xì)胞最為常用。B淋巴細(xì)胞則沒有紅細(xì)胞受體，所以不能形成E—玫瑰花環(huán)，以資鑒別。
材料與試劑
1．肝素抗凝劑
2．淋巴細(xì)胞分層液 配制方法見細(xì)胞分離技術(shù)。
3．無Ca2 、Mg2 Hank’s液
NaCl 4.00g
NaHCO3 0.175g
KCl 0.20g
Na2HPO4.12H2O 0.076g
KH2PO4 0.030g
葡萄糖 0.50g
H2O加至 500.00ml
用5.6％NaHCO3調(diào)pH至7.2，115℃15min滅菌。4℃貯藏備用。
4．5.6％NaHCO3液
NaHCO3 5.60g
H2O 100.00ml
115℃20min滅菌, 4℃貯藏備用。
5．0.8％戊二醛溶液
25％戊二醛溶液 0.32ml
Hank’s液 9.68ml
用前配制。
6．Giemsa—weight染色液
Giemsa粉 0.03g
Weight粉 0.30g
甲醇 100.00ml
先將染料一起放入研缽內(nèi)，加入少量甲醇，研磨細(xì)，然后倒入瓶內(nèi)，并用甲醇沖洗研缽內(nèi)染料，一起倒入玻瓶內(nèi)，補(bǔ)足甲醇量，備用。
操作方法
1．取肝素抗凝血2ml，置37℃水浴自然沉淀30min～40min，吸取全部血漿（約1ml）。
2．于血漿中加Hank’s液數(shù)毫升，洗滌，1 500r/min離心5min～10min，棄上清。重復(fù)洗滌4次，沉淀均勻即為淋巴細(xì)胞懸液。
3．采綿羊肝素抗凝血，加數(shù)倍Hank’s液，洗滌3次，最后以Hank’s配成10％懸液，4℃保存。
4．取0.1ml淋巴細(xì)胞懸液，加10％紅血球懸液0.1ml，加小牛血清0.1ml。
5．37℃水浴10min，低速離心（600r/min）5min。
6．吸棄多余的上清液后，放入4℃冰箱2h～4h。
7．取出后，將沉淀輕輕搖起，加0.8％戊二醛0.1ml，混勻后4℃固定15min。
8．將干凈的玻片用Hank’s液沾濕，滴一小滴混懸液，讓其自然散開即可。
9．自然干燥后，用姬姆薩—瑞氏液（Giomsa—weight）或蘇木精—伊紅染色，水洗，干燥鏡檢。
結(jié)果判定
凡一個(gè)淋巴細(xì)胞結(jié)合3個(gè)或3個(gè)以上的紅細(xì)胞者為一個(gè)E—玫瑰環(huán)。檢查200個(gè)淋巴細(xì)胞，計(jì)算其玫瑰花環(huán)形成率。
注意事項(xiàng)
1．影響E—玫瑰花環(huán)試驗(yàn)最主要的因素淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞的新鮮程度，被檢血樣必須新鮮，無菌，采血后要求在3h～4h內(nèi)進(jìn)行檢驗(yàn)，否則由于淋巴細(xì)胞的死亡，受體脫落，影響檢查結(jié)果。紅細(xì)胞用阿氏液保存最多不要超過3周，且不應(yīng)溶血。
2．控制好反應(yīng)溫度、時(shí)間等條件對玫瑰花環(huán)形成率有較大影響。選37℃作用10min，低速離心5min，置4℃ 2h～4h，其結(jié)果穩(wěn)定性較好，結(jié)合率較高。如在37℃作用時(shí)間較長，可見玫瑰花環(huán)發(fā)生變形，結(jié)合部位松弛、拉開，甚至解離。
3．指示紅血球的動(dòng)物種類也與玫瑰花環(huán)的形成率有關(guān)。如馬淋巴細(xì)胞與豚鼠紅細(xì)胞結(jié)合較好，而驢則與綿羊紅血球結(jié)合較好。Melinda氏報(bào)道，人、馬、牛、豬、狗、貓、鼠與豚鼠紅細(xì)胞的結(jié)合率都高于綿羊紅細(xì)胞的結(jié)合率。
4．加犢牛血清能增加玫瑰花環(huán)形成細(xì)胞的穩(wěn)定性，增強(qiáng)與指示紅細(xì)胞結(jié)合的牢固性。
5．Hank’s液的pH以7.2～7.4為宜。