單克隆抗體的制備方法

動(dòng)物的選擇與免疫

　　1．動(dòng)物的選擇 　純種BALB/C小鼠，較溫順，離窩的活動(dòng)范圍小，體弱，食量及排污較小，一般環(huán)境潔凈的實(shí)驗(yàn)室均能飼養(yǎng)成活。目前開展雜交瘤技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室多選用純種BALA/C小鼠。

　　2．免疫方案 　　選擇合適的免疫方案對(duì)于細(xì)胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要。一般在融合前兩個(gè)月左右根據(jù)確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。

　�。�1）可溶性抗原免疫原性較弱，一般要加佐劑，半抗原應(yīng)先制備免疫原，再加佐劑。常用佐劑：福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑。

　　初次免疫 抗原1～50μg加福氏完全佐劑皮下多點(diǎn)注射或脾內(nèi)注射（一般0.8～1ml,0.2ml/點(diǎn)）

　　↓3周后

　　第二次免疫 劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip（腹腔內(nèi)注射）（ip劑量不宜超過0.5ml）

　　↓3周后

　　第三次免疫 劑量同一，不加佐劑，ip（5～7天后采血測(cè)其效價(jià)）

　　↓2～3周

　　加強(qiáng)免疫，劑量50～500μg為宜，ip或iv（靜脈內(nèi)注射）

　　↓3天后

　　取脾融合

　　目前，用于可溶性抗原（特別是一些弱抗原）的免疫方案也不斷有所更新，如：①將可溶性抗原顆粒化或固相化，一方面增強(qiáng)了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。③使用細(xì)胞因子作為佐劑，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)抗原的反應(yīng)性。

　　（2）顆�？乖�免疫性強(qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。以細(xì)胞性抗原為例，免疫時(shí)要求抗原量為1～2×107個(gè)細(xì)胞。

　　初次免疫 1×107/0.5ml ip

　　↓2～3周后

　　第二次免疫 1×107/0.5ml ip

　　↓3周后

　　加強(qiáng)免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv

　　↓

　　取脾融合

細(xì)胞融合

　　1．細(xì)胞融合前準(zhǔn)備

　　（1）骨髓瘤細(xì)胞系的選擇：骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)和免疫動(dòng)物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAb。常用的骨髓瘤細(xì)胞系見表2-4。

表2-4用于融合試驗(yàn)的主要骨髓瘤細(xì)胞系

　　骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)可用一般的培養(yǎng)液，如RPMI1640，DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在10%～20%，細(xì)胞濃度以104～5×105/ml為宜，最大濃度不得超過106/ml。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的中期時(shí)，可按1：3～1：10的比例傳代。每3～5天傳代一次。細(xì)胞在傳代過程中，部分細(xì)胞可能有返祖現(xiàn)象，應(yīng)定期用8-氮鳥嘌呤進(jìn)行處理，使生存的細(xì)胞對(duì)HAT呈均一的敏感性。

　　（2）飼養(yǎng)細(xì)胞：在組織培養(yǎng)中，單個(gè)或少數(shù)分散的細(xì)胞不易生長(zhǎng)繁殖，若加入其它活細(xì)胞，則可促進(jìn)這些細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，所加入的這種細(xì)胞數(shù)被稱為飼養(yǎng)細(xì)胞。在制備McAb的過程中，許多環(huán)節(jié)　需要加飼養(yǎng)細(xì)胞，如在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)過程中，加入飼養(yǎng)細(xì)胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（較為常用）、小鼠脾臟細(xì)胞或胸腺細(xì)胞。也有人用小鼠成纖維細(xì)胞系3T3經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞的量為一般為2×104或105細(xì)胞/孔。

　　2．細(xì)胞融合的步驟

　　（1）制備飼養(yǎng)細(xì)胞層：一般選用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。

　　與免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周

↓

　　拉頸 處死，浸泡在75%酒精內(nèi)，3～5min

　　↓

　　用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜

　　↓

　　用無菌注射器注入5～6ml預(yù)冷的培養(yǎng)液（嚴(yán)禁刺破腸管）

　　↓

　　反復(fù)沖洗，吸出沖洗液

　　↓

　　沖洗液放入10ml離心管，1200rpm/分離5～6min

　　↓

　　用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×105/ml

　　↓

　　加入96孔板，100μl/孔

　　↓

　　放入37。c CO2孵箱培養(yǎng)

　�。�2）制備免疫脾細(xì)胞

　　最后一次加強(qiáng)免疫3天后小鼠拉頸處死

　　↓

　　無菌取脾臟，培養(yǎng)液洗 一次

　　↓

　　脾臟研碎，過不銹鋼篩網(wǎng)

　　↓

　　離心，細(xì)胞用培養(yǎng)液洗2次

　　↓

　　計(jì)數(shù)

　　↓

　　取108脾淋巴細(xì)胞懸液備用

　�。�3）制備骨髓瘤細(xì)胞

　　取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)骨髓瘤細(xì)胞離心

　　↓

　　用無血清培養(yǎng)液洗2次

　　↓

　　計(jì)數(shù)，取得×107細(xì)胞備用

　�。�4）融合

　�、賹⒐撬枇黾�(xì)胞與脾細(xì)胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml離心管中用無血清不完全培養(yǎng)液洗1次，離心，1200rpm,8min;棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇（PEG）濃度。輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略松動(dòng)。

　　②90s內(nèi)加入37℃預(yù)溫的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，邊加邊輕微搖動(dòng)。37℃水浴作用90s。

　　③加37。C預(yù)溫的不完全培養(yǎng)液以終止PEG作用，每隔2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。

　　④離心，800rpm, 6min。

　　⑤充上清，用含20%小牛血清HAT選擇培養(yǎng)液重懸。

　�、迣⑸鲜黾�(xì)胞，加到已有飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孔板內(nèi)，每孔加100μl。一般一個(gè)免疫脾臟可接種4塊96孔板。

　�、邔⑴囵B(yǎng)板置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

選擇雜交瘤細(xì)胞及抗體檢測(cè)

　　1．HAT選擇雜交瘤細(xì)胞 　　　脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)PEG處理后，形成多種細(xì)胞的混合體，只有脾細(xì)胞與骨髓細(xì)胞形成的雜交瘤細(xì)胞才有意義。在HAT選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)時(shí)，由于骨髓瘤細(xì)胞缺乏胸苷激酶或次黃嘌呤鳥嘌呤核糖轉(zhuǎn)移酶，故不能生長(zhǎng)繁殖，而雜交瘤細(xì)胞具有上述兩種酶，在HAT選擇培養(yǎng)液可以生長(zhǎng)繁殖。

　　在用HAT選擇培養(yǎng)1～2天內(nèi)，將有大量瘤細(xì)胞死亡，3～4天后瘤細(xì)胞消失，雜交細(xì)胞形成小集落，HAT選擇培養(yǎng)液維持7～10天后應(yīng)換用HT培養(yǎng)液，再維持2周，改用一般培養(yǎng)液。在上述選擇培養(yǎng)期間，雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1/10面積時(shí)，即可開始檢測(cè)特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。在選擇培養(yǎng)期間，一般每2～3天換一半培養(yǎng)液。

　　2．抗體的檢測(cè)　　 檢測(cè)抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡(jiǎn)便、特異、敏感的方法為原則。

　　常用的方法有：（1）放射免疫測(cè)定（RIA）可用于可溶性抗原、細(xì)胞McAb的檢測(cè)。（2）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）可用于可溶性抗原、細(xì)胞和病毒等McAb的檢測(cè)。（3）免疫熒光試驗(yàn)適合于細(xì)胞表面抗原的McAb的檢測(cè)。（4）其它如間接血凝試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、旋轉(zhuǎn)粘附雙層吸附試驗(yàn)等。

雜交瘤的克隆化

　　雜交瘤克隆化一般是指將抗體陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化。因?yàn)榻?jīng)過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個(gè)孔內(nèi)只有一個(gè)克隆。在實(shí)際工作中，可能會(huì)有數(shù)個(gè)甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞、所需要的抗體（特異性抗體）分泌細(xì)胞和其它無關(guān)抗體的分泌細(xì)胞。要想將這些細(xì)胞彼此分開就需要克隆化�？寺』�的原則是，對(duì)于檢測(cè)抗體陽(yáng)性的雜交克隆盡早進(jìn)行克隆化，否則抗體分泌的細(xì)胞會(huì)被抗體非分泌的細(xì)胞所抑制，因?yàn)榭贵w非分泌細(xì)胞的生長(zhǎng)速度比抗體分泌的細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，二者競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果會(huì)使抗體分泌的細(xì)胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細(xì)胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細(xì)胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。

　　克隆化的方法很多，最常用的是有限稀釋法和軟瓊脂平板法。

　　1．有限稀釋法克隆

　�。�1）克隆前1天制備飼養(yǎng)細(xì)胞層（同細(xì)胞融合）。

　　2）將要克隆的雜交瘤細(xì)胞從培養(yǎng)孔內(nèi)輕輕吹干，計(jì)數(shù)。

　�。�3）調(diào)整細(xì)胞為3～10個(gè)細(xì)胞/ml。

　�。�4）取頭天準(zhǔn)備的飼養(yǎng)細(xì)胞層的細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入稀釋細(xì)胞100μl。孵育于37℃、5%CO2孵箱中 。

　　（5）在第7天換液，以后每2～3天換液1次。

　　（6）8～9天可見 細(xì)胞克隆形成，及時(shí)檢測(cè)抗體活性。

　　（7）將陽(yáng)性孔的細(xì)胞移至24孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)。

　�。�8）每個(gè)克隆應(yīng)盡快凍存。

　　2．軟瓊脂培養(yǎng)法克隆

　�。�1）軟瓊脂的配制：含有20%NCS（小牛血清）的2倍濃縮的RPMI1640。

　�、�1%瓊脂水溶液：高壓滅菌，42℃預(yù)熱。

　�、�0.5%瓊脂：由1份1%瓊脂加1份含20%小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42℃保溫。

　　（2）用上述0.5%瓊脂液（含有飼養(yǎng)細(xì)胞）15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。

　　（3）按100/ml，500/ml或5000/ml等濃度配制需克隆的細(xì)胞懸液。

　�。�4）1ml 0.5%瓊脂液（42℃預(yù)熱）在室溫中分別與1ml不同濃度的細(xì)胞懸液相混合。

　�。�5）混勻后立傾注于瓊脂基底層上，在室溫中10min，使其凝固，孵育于37℃、5%CO2孵箱中。

　�。�6）4～5天 后即可見針尖大小白色克隆，7～10天后，直接移種至含飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔中進(jìn)行培養(yǎng)。

　�。�7）檢測(cè)抗體，擴(kuò)大培養(yǎng)，必要是地再克隆化。

雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇

　　1．雜交瘤細(xì)胞的凍存　　 及時(shí)凍存原始孔的雜交瘤細(xì)胞每次克隆化得到的亞克隆細(xì)胞是十分重要的。因?yàn)樵跊]有建立一個(gè)穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞系的時(shí)候，細(xì)胞的培養(yǎng)過程中隨時(shí)可能發(fā)生細(xì)胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細(xì)胞的凍存，則可因上述意外而前功盡棄。

　　雜交瘤細(xì)胞的凍存方法同其他細(xì)胞系的凍存方法一樣，原則上細(xì)胞應(yīng)在每支安瓿含1×106以上，但對(duì)原始孔的雜交瘤細(xì)胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當(dāng)長(zhǎng)滿孔底時(shí)，一孔就可以裝一支安瓿凍存。

　　細(xì)胞凍存液：50%小牛血清；40%不完全培養(yǎng)液；10%DMSO（二甲基亞砜）。

　　凍存液最好預(yù)冷，操作動(dòng)作輕柔、迅速。凍存時(shí)從室溫可立即降至0℃后放入-70℃超低溫冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮中。也可用細(xì)胞凍存裝置進(jìn)行凍存。凍存細(xì)胞要定期復(fù)蘇，檢查細(xì)胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性，在液氮中細(xì)胞可保存數(shù)年或更長(zhǎng)時(shí)間。

　　2．細(xì)胞復(fù)蘇方法 　將玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min內(nèi)使凍存的細(xì)胞解凍，將細(xì)胞用完全培養(yǎng)液洗滌兩次，然后移入頭天已制備好的飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞形成集落時(shí)，檢測(cè)抗體活性。

單克隆抗體的大量生產(chǎn)

　　大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：

　�。�1）體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從一清液中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液內(nèi)抗體含量為10～60μg/ml,如果大量生產(chǎn)，費(fèi)用較高。

　�。�2）體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，制備腹水或血清。

　　①實(shí)體瘤法：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞按1～3×107/ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2ml,共2～4點(diǎn)。待腫瘤達(dá)到一定大小后（一般10～20天）則可采血，從血清中獲得單克隆 抗體的含量可達(dá)到1～10mg/ml。但采血量有限。

　�、诟顾�的制備：常規(guī)是先腹腔注射0.5ml Pristane (降植烷)或液體石蠟于BALB/C鼠，1～2周后腹腔注射1×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7～10天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動(dòng)物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲5～10ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達(dá)到5～10mg/ml，這是目前最常用的方法，還可將腹水中細(xì)胞凍存起來，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水塊、量多。

單克隆抗體的鑒定

　　對(duì)制備的McAb進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的，應(yīng)做下述幾個(gè)方面的鑒定：

　　1．抗體特異性的鑒定 　　除用免疫原（抗原）進(jìn)行抗體的檢測(cè)外，還應(yīng)該用與其抗原成分相關(guān)的其它抗原進(jìn)行交叉試驗(yàn)，方法可用ELISA、IFA法。例如：①制備抗黑色素瘤細(xì)胞的McAb，除用黑色素瘤細(xì)胞反應(yīng)外，還應(yīng)該用其它臟器的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞進(jìn)行交叉反應(yīng)，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體。②制備抗重組的細(xì)胞因子的單克隆抗體，應(yīng)首先考慮是否與表達(dá)菌株的蛋白有交叉反應(yīng)，其次是與其它細(xì)胞因子間有無交叉。

　　2．McAb的Ig類與亞類的鑒定　　一般在用酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行篩選時(shí)已經(jīng)基本上確定了抗體的Ig類型。如果用的是酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測(cè)出來的抗體一般是IgG類或IgM類。至于亞類則需要用標(biāo)準(zhǔn)抗亞類血清系統(tǒng)作雙擴(kuò)或夾心ELISA來確定。在作雙擴(kuò)試驗(yàn)時(shí)，如加入適量的PEG（3%），更有利于沉淀線的形成。

　　3．McAb中和活性的鑒定 　　　用動(dòng)物或細(xì)胞的保護(hù)實(shí)驗(yàn)來確定McAb的生物學(xué)活性。例如，如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時(shí)接種于易感的動(dòng)物或敏感的細(xì)胞，來觀察動(dòng)物或細(xì)胞是否得到抗體的保護(hù)。

　　4．McAb識(shí)別抗原表位的鑒定　　用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)，測(cè)相加指數(shù)的方法，測(cè)定McAb所識(shí)別抗原位點(diǎn)，來確定McAb的識(shí)別的表位是否相同。

　　5．McAb親合力的鑒定　 用ELISA或RIA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)來確定McAb與相應(yīng)抗原結(jié)合的親合力。