一、 引言
從1962年，Clark和Lyons最先提出生物傳感器的設(shè)想距今已有40 年。生物傳感器在發(fā)酵工藝、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品工程、臨床醫(yī)學(xué)、軍事及軍事醫(yī)學(xué)等方面得到了深度重視和廣泛應(yīng)用。在最初15年里，生物傳感器主要是以研制酶電極制作的生物傳感器為主，但是由于酶的價(jià)格昂貴并不夠穩(wěn)定，因此以酶作為敏感材料的傳感器，其應(yīng)用受到一定的限制。
近些年來，微生物固定化技術(shù)的不斷發(fā)展，產(chǎn)生了微生物電極。微生物電極以微生物活體作為分子識(shí)別元件，與酶電極相比有其獨(dú)到之處。它可以克服價(jià)格昂貴、提取困難及不穩(wěn)定等弱點(diǎn)。此外，還可以同時(shí)利用微生物體內(nèi)的輔酶處理復(fù)雜反應(yīng)。而目前，光纖生物傳感器的應(yīng)用也越來越廣泛。而且隨著聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）的發(fā)展，應(yīng)用PCR的DNA生物傳感器也越來越多。
二、 研究現(xiàn)狀及主要應(yīng)用領(lǐng)域
1、 發(fā)酵工業(yè)
各種生物傳感器中，微生物傳感器最適合發(fā)酵工業(yè)的測(cè)定。因?yàn)榘l(fā)酵過程中常存在對(duì)酶的干擾物質(zhì)，并且發(fā)酵液往往不是清澈透明的，不適用于光譜等方法測(cè)定。而應(yīng)用微生物傳感器則極有可能消除干擾，并且不受發(fā)酵液混濁程度的限制。同時(shí)，由于發(fā)酵工業(yè)是大規(guī)模的生產(chǎn)，微生物傳感器其成本低設(shè)備簡(jiǎn)單的特點(diǎn)使其具有極大的優(yōu)勢(shì)。
(1). 原材料及代謝產(chǎn)物的測(cè)定
微生物傳感器可用于原材料如糖蜜、乙酸等的測(cè)定，代謝產(chǎn)物如頭孢霉素、谷氨酸、甲酸、甲烷、醇類、青霉素、乳酸等的測(cè)定。測(cè)量的原理基本上都是用適合的微生物電極與氧電極組成，利用微生物的同化作用耗氧，通過測(cè)量氧電極電流的變化量來測(cè)量氧氣的減少量，從而達(dá)到測(cè)量底物濃度的目的。
在各種原材料中葡萄糖的測(cè)定對(duì)過程控制尤其重要，用熒光假單胞菌（Psoudomonas fluorescens）代謝消耗葡萄糖的作用，通過氧電極進(jìn)行檢測(cè)，可以估計(jì)葡萄糖的濃度。這種微生物電極和葡萄糖酶電極型相比，測(cè)定結(jié)果是類似的，而微生物電極靈敏度高，重復(fù)實(shí)用性好，而且不必使用昂貴的葡萄糖酶。
當(dāng)乙酸用作碳源進(jìn)行微生物培養(yǎng)時(shí)，乙酸含量高于某一濃度會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)，因此需要在線測(cè)定。用固定化酵母（Trichosporon brassicae），透氣膜和氧電極組成的微生物傳感器可以測(cè)定乙酸的濃度。
此外，還有用大腸桿菌（E.coli）組合二氧化碳?xì)饷綦姌O，可以構(gòu)成測(cè)定谷氨酸的微生物傳感器，將檸檬酸桿菌完整細(xì)胞固定化在膠原蛋白膜內(nèi)，由細(xì)菌—膠原蛋白膜反應(yīng)器和組合式玻璃電極構(gòu)成的微生物傳感器可應(yīng)用于發(fā)酵液中頭孢酶素的測(cè)定等等。
(2). 微生物細(xì)胞總數(shù)的測(cè)定
在發(fā)酵控制方面，一直需要直接測(cè)定細(xì)胞數(shù)目的簡(jiǎn)單而連續(xù)的方法。人們發(fā)現(xiàn)在陽極表面，細(xì)菌可以直接被氧化并產(chǎn)生電流。這種電化學(xué)系統(tǒng)已應(yīng)用于細(xì)胞數(shù)目的測(cè)定，其結(jié)果與傳統(tǒng)的菌斑計(jì)數(shù)法測(cè)細(xì)胞數(shù)是相同的[1]。
(3). 代謝試驗(yàn)的鑒定
傳統(tǒng)的微生物代謝類型的鑒定都是根據(jù)微生物在某種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況進(jìn)行的。這些實(shí)驗(yàn)方法需要較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間和專門的技術(shù)。微生物對(duì)底物的同化作用可以通過其呼吸活性進(jìn)行測(cè)定。用氧電極可以直接測(cè)量微生物的呼吸活性。因此，可以用微生物傳感器來測(cè)定微生物的代謝特征。這個(gè)系統(tǒng)已用于微生物的簡(jiǎn)單鑒定、微生物培養(yǎng)基的選擇、微生物酶活性的測(cè)定、廢水中可被生物降解的物質(zhì)估計(jì)、用于廢水處理的微生物選擇、活性污泥的同化作用試驗(yàn)、生物降解物的確定、微生物的保存方法選擇等[2]。
2、 環(huán)境監(jiān)測(cè)
(1). 生化需氧量的測(cè)定
生化需氧量（biochemical oxygen demand –BOD）的測(cè)定是監(jiān)測(cè)水體被有機(jī)物污染狀況的最常用指標(biāo)。常規(guī)的BOD測(cè)定需要5天的培養(yǎng)期，操作復(fù)雜、重復(fù)性差、耗時(shí)耗力、干擾性大，不宜現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)，所以迫切需要一種操作簡(jiǎn)單、快速準(zhǔn)確、自動(dòng)化程度高、適用廣的新方法來測(cè)定。目前，有研究人員分離了兩種新的酵母菌種SPT1和SPT2，并將其固定在玻璃碳極上以構(gòu)成微生物傳感器用于測(cè)量BOD，其重復(fù)性在±10%以內(nèi)。將該傳感器用于測(cè)量紙漿廠污水中BOD的測(cè)定，其測(cè)量最小值可達(dá)2 mg/l，所用時(shí)間為5min[3]。還有一種新的微生物傳感器，用耐高滲透壓的酵母菌種作為敏感材料，在高滲透壓下可以正常工作。并且其菌株可長(zhǎng)期干燥保存，浸泡后即恢復(fù)活性，為海水中BOD的測(cè)定提供了快捷簡(jiǎn)便的方法[4]。
除了微生物傳感器，還有一種光纖生物傳感器已經(jīng)研制出來用于測(cè)定河水中較低的BOD值。該傳感器的反應(yīng)時(shí)間是15min，最適工作條件為30°C，pH=7。這個(gè)傳感器系統(tǒng)幾乎不受氯離子的影響（在1000mg/l范圍內(nèi)），并且不被重金屬（Fe3 、Cu2 、Mn2 、Cr3 、Zn2 ）所影響。該傳感器已經(jīng)應(yīng)用于河水BOD的測(cè)定，并且獲得了較好的結(jié)果[4]。
現(xiàn)在有一種將BOD生物傳感器經(jīng)過光處理（即以TiO2作為半導(dǎo)體，用6 W燈照射約4min）后，靈敏度大大提高，很適用于河水中較低BOD的測(cè)量[5]。同時(shí)，一種緊湊的光學(xué)生物傳感器已經(jīng)發(fā)展出來用于同時(shí)測(cè)量多重樣品的BOD值。它使用三對(duì)發(fā)光二極管和硅光電二極管，假單胞細(xì)菌（Pseudomonas fluorescens）用光致交聯(lián)的樹脂固定在反應(yīng)器的底層，該測(cè)量方法既迅速又簡(jiǎn)便，在4℃下可使用六周，已經(jīng)用于工廠廢水處理的過程中[5]。
(2). 各種污染物的測(cè)定
常用的重要污染指標(biāo)有氨、亞硝酸鹽、硫化物、磷酸鹽、致癌物質(zhì)與致變物質(zhì)、重金屬離子、酚類化合物、表面活性劑等物質(zhì)的濃度。目前已經(jīng)研制出了多種測(cè)量各類污染物的生物傳感器并已投入實(shí)際應(yīng)用中了。
測(cè)量氨和硝酸鹽的微生物傳感器，多是用從廢水處理裝置中分離出來的硝化細(xì)菌和氧電極組合構(gòu)成。目前有一種微生物傳感器可以在黑暗和有光的條件下測(cè)量硝酸鹽和亞硝酸鹽(NOx-)，它在鹽環(huán)境下的測(cè)量使得它可以不受其他種類的氮的氧化物的影響。用它對(duì)河口的NOx-進(jìn)行了測(cè)量，其效果較好[6]。
硫化物的測(cè)定是用從硫鐵礦附近酸性土壤中分離篩選得到的專性、自養(yǎng)、好氧性氧化硫硫桿菌制成的微生物傳感器。在pH=2.5、31℃時(shí)一周測(cè)量200余次，活性保持不變，兩周后活性降低20%。傳感器壽命為7天，其設(shè)備簡(jiǎn)單，成本低，操作方便。目前還有用一種光微生物電極測(cè)硫化物含量，所用細(xì)菌是Chromatium.SP，與氫電極連接構(gòu)成[7]。
最近科學(xué)家們?cè)谖廴緟^(qū)分離出一種能夠發(fā)熒光的細(xì)菌，此種細(xì)菌含有熒光基因，在污染源的刺激下能夠產(chǎn)生熒光蛋白，從而發(fā)出熒光�？梢酝ㄟ^遺傳工程的方法將這種基因?qū)牒线m的細(xì)菌內(nèi)，制成微生物傳感器，用于環(huán)境監(jiān)測(cè)�，F(xiàn)在已經(jīng)將熒光素酶導(dǎo)入大腸桿菌（E.coli）中，用來檢測(cè)砷的有毒化合物[8]。
水體中酚類和表面活性劑的濃度測(cè)定已經(jīng)有了很大的發(fā)展。目前，有9種革蘭氏陰性細(xì)菌從西西伯利亞石油盆地的土壤中分離出來，以酚作為唯一的碳源和能源。這些菌種可以提高生物傳感器的感受器部分的靈敏度。它對(duì)酚的監(jiān)測(cè)極限為5 ´10-9mol。該傳感器工作的最適條件為：pH=7.4、35℃，連續(xù)工作時(shí)間為30h[9]。還有一種假單胞菌屬（Pseudomonas rathonis）制成的測(cè)量表面活性劑濃度的電流型生物傳感器，將微生物細(xì)胞固定在凝膠（瓊脂、瓊脂糖和海藻酸鈣鹽）和聚乙醇膜上，可以用層析試紙GF/A，或者是谷氨酸醛引起的微生物細(xì)胞在凝膠中的交聯(lián)，長(zhǎng)距離的保持它們?cè)诟邼舛缺砻婊钚詣z測(cè)中的活性和生長(zhǎng)力。該傳感器能在測(cè)量結(jié)束后很快的恢復(fù)敏感元件的活性[10]。
還有一種電流式生物傳感器，用于測(cè)定有機(jī)磷殺蟲劑，使用的是人造酶。利用有機(jī)磷殺蟲劑水解酶，對(duì)硝基酚和二乙基酚的測(cè)量極限為100´10-9mol，在40℃只要4min[11]。還有一種新發(fā)展起來的磷酸鹽生物傳感器，使用丙酮酸氧化酶G，與自動(dòng)系統(tǒng)CL-FIA臺(tái)式電腦結(jié)合，可以檢測(cè)(32~96)´10-9mol的磷酸鹽，在25°C下可以使用兩周以上，重復(fù)性高[12]。
最近，有一種新型的微生物傳感器，用細(xì)菌細(xì)胞作為生物組成部分，測(cè)定地表水中壬基酚（nonyl-phenol etoxylate --NP-80E）的含量。用一個(gè)電流型氧電極作傳感器，微生物細(xì)胞固定在氧電極上的透析膜上，其測(cè)量原理是測(cè)量毛孢子菌屬（Trichosporum grablata）細(xì)胞的呼吸活性。該生物傳感器的反應(yīng)時(shí)間為15~20min，壽命為7~10天（用于連續(xù)測(cè)定時(shí)）。在濃度范圍0.5~6.0mg/l內(nèi)，電信號(hào)與NP-80E濃度呈線性關(guān)系，很適合于污染的地表水中分子表面活性劑的檢測(cè)[13]。
除此之外，污水中重金屬離子濃度的測(cè)定也是不容忽視的。目前已經(jīng)成功設(shè)計(jì)了一個(gè)完整的，基于固定化微生物和生物體發(fā)光測(cè)量技術(shù)上的重金屬離子生物有效性測(cè)定的監(jiān)測(cè)和分析系統(tǒng)。將弧菌屬細(xì)菌（Vibrio fischeri）體內(nèi)的一個(gè)操縱子在一個(gè)銅誘導(dǎo)啟動(dòng)子的控制下導(dǎo)入產(chǎn)堿桿菌屬細(xì)菌（Alcaligenes eutrophus (AE1239)）中，細(xì)菌在銅離子的誘導(dǎo)下發(fā)光，發(fā)光程度與離子濃度成正比。將微生物和光纖一起包埋在聚合物基質(zhì)中，可以獲得靈敏度高、選擇性好、測(cè)量范圍廣、儲(chǔ)藏穩(wěn)定性強(qiáng)的生物傳感器。目前，這種微生物傳感器可以達(dá)到最低測(cè)量濃度1´10-9mol[14]。
還有一種專門測(cè)量銅離子的電流型微生物傳感器。它用酒釀酵母（Saccharomyces cerevisiae）重組菌株作為生物元件，這些菌株帶有酒釀酵母CUP1基因上的銅離子誘導(dǎo)啟動(dòng)子與大腸桿菌lacZ基因的融合體。其工作原理，首先是CUP1啟動(dòng)子被Cu2 誘導(dǎo)，隨后乳糖被用作底物進(jìn)行測(cè)量。如果Cu2 存在于溶液中，這些重組體細(xì)菌就可以利用乳糖作為碳源，這將導(dǎo)致這些好氧細(xì)胞需氧量的改變。該生物傳感器可以在濃度范圍(0.5~2)´10-3mol范圍內(nèi)測(cè)定CuSO4溶液。目前已經(jīng)將各類金屬離子誘導(dǎo)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，使得大腸桿菌會(huì)在含有各種金屬離子的的溶液中出現(xiàn)發(fā)光反應(yīng)。根據(jù)它發(fā)光的強(qiáng)度可以測(cè)定重金屬離子的濃度，其測(cè)量范圍可以從納摩爾到微摩爾，所需時(shí)間為60~100min[15][16]。
用于測(cè)量污水中鋅濃度的生物傳感器也已經(jīng)研制成功，使用嗜堿性細(xì)菌Alcaligenes cutrophus，并用于對(duì)污水中鋅的濃度和生物有效性進(jìn)行測(cè)量，其結(jié)果令人滿意[17]。
估測(cè)河口出水流污染情況的海藻傳感器是由一種螺旋藻屬藍(lán)細(xì)菌（ cyanobacterium Spirlina subsalsa）和一個(gè)氣敏電極構(gòu)成的。通過監(jiān)測(cè)光合作用被抑制的程度來估測(cè)由于環(huán)境污染物的存在而引起水的毒性變化。以標(biāo)準(zhǔn)天然水為介質(zhì)，對(duì)三種主要污染物（重金屬、除草劑、氨基甲酸鹽殺蟲劑）的不同濃度進(jìn)行了測(cè)定，均可監(jiān)測(cè)到它們的有毒反應(yīng)，重復(fù)性和再生性都很高[18]。
近來由于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）的迅猛發(fā)展及其在環(huán)境監(jiān)測(cè)方面的廣泛應(yīng)用，不少科學(xué)家開始著手于將它與生物傳感器技術(shù)結(jié)合應(yīng)用。有一種應(yīng)用PCR技術(shù)的DNA壓電生物傳感器，可以測(cè)定一種特殊的細(xì)菌毒素。將生物素�；奶结樄潭ㄔ谘b有鏈酶抗生素鉑金表面的石英晶體上，用1´10-6mol的鹽酸可以使循環(huán)式測(cè)量在同一晶體表面進(jìn)行。用細(xì)菌中提取的DNA樣品進(jìn)行同樣的雜交反應(yīng)并由PCR放大，產(chǎn)物為氣單胞菌屬（Aeromonas hydrophila）的一種特殊基因片斷。這種壓電生物傳感器可以鑒別樣品中是否含有這種基因，這為從水樣中檢測(cè)是否含帶有這種病原的各種氣單胞菌提供了可能[19]。
還有一種通道生物傳感器可以檢測(cè)浮游植物和水母等生物體產(chǎn)生的腰鞭毛蟲神經(jīng)毒素等毒性物質(zhì)，目前已經(jīng)能夠測(cè)量在一個(gè)浮游生物細(xì)胞內(nèi)含有的極微量的PSP毒素[20]。DNA傳感器也在迅速的得到應(yīng)用，目前有一種小型化DNA生物傳感器，能將DNA識(shí)別信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，用于測(cè)量水樣中隱孢子和其他水源傳染體。該傳感器著重于改進(jìn)核酸的識(shí)別作用和加強(qiáng)該傳感器的特異性和靈敏性，并尋求將雜交信號(hào)轉(zhuǎn)化為有用信號(hào)的新方法，目前研究工作為識(shí)別裝置和轉(zhuǎn)換裝置的一體化[21]。
微藻素是一種從藍(lán)藻細(xì)菌引起的水華中產(chǎn)生的細(xì)菌肝毒素，一種固定有表面細(xì)胞質(zhì)�；蚪M的生物傳感器已經(jīng)制得，用于測(cè)量水中微藻素的含量，它直接的測(cè)量范圍是50~1000 ´10-6g/l[22]。
一種基于酶的抑制性分析的多重生物傳感器用于測(cè)量毒性物質(zhì)的設(shè)想也已經(jīng)提出。在這種多重生物傳感器中，應(yīng)用了兩種傳導(dǎo)器—對(duì)pH敏感的電子晶體管和熱敏性的薄膜電極，以及三種酶—尿素酶、乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶。該生物傳感器的性能已經(jīng)得到測(cè)試，效果較好[23]。
除了發(fā)酵工業(yè)和環(huán)境監(jiān)測(cè)，生物傳感器還深入的應(yīng)用于食品工程、臨床醫(yī)學(xué)、軍事及軍事醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，主要用于測(cè)量葡萄糖、乙酸、乳酸、乳糖、尿酸、尿素、抗生素、谷氨酸等各種氨基酸，以及各種致癌和致變物質(zhì)。
三、 討論與展望
美國(guó)的Harold H.Weetal指出，生物傳感器商品化要具備以下幾個(gè)條件：足夠的敏感性和準(zhǔn)確性、易操作、價(jià)格便宜、易于批量生產(chǎn)、生產(chǎn)過程中進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)測(cè)。其中，價(jià)格便宜決定了傳感器在市場(chǎng)上有無競(jìng)爭(zhēng)力。而在各種生物傳感器中，微生物傳感器最大的優(yōu)點(diǎn)就是成本低、操作簡(jiǎn)便、設(shè)備簡(jiǎn)單，因此其在市場(chǎng)上的前景是十分巨大和誘人的。相比起來，酶生物傳感器等的價(jià)格就比較昂貴。但微生物傳感器也有其自身的缺點(diǎn)，主要的缺點(diǎn)就是選擇性不夠好，這是由于在微生物細(xì)胞中含有多種酶引起的�，F(xiàn)已有報(bào)道加專門抑制劑以解決微生物電極的選擇性問題。除此之外，微生物固定化方法也需要進(jìn)一步完善，首先要盡可能保證細(xì)胞的活性，其次細(xì)胞與基礎(chǔ)膜結(jié)合要牢固，以避免細(xì)胞的流失。另外，微生物膜的長(zhǎng)期保存問題也待進(jìn)一步的改進(jìn)，否則難于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的商品化。
總之，常用的微生物電極和酶電極在各種應(yīng)用中各有其優(yōu)越之處。若容易獲得穩(wěn)定、高活性、低成本的游離酶，則酶電極對(duì)使用者來說是最理想的。相反的，若生物催化需經(jīng)過復(fù)雜途徑，需要輔酶，或所需酶不宜分離或不穩(wěn)定時(shí)，微生物電極則是更理想的選擇。而其他各種形式的生物傳感器也在蓬勃發(fā)展中，其應(yīng)用也越來越廣泛。隨著固定化技術(shù)的進(jìn)一步完善，隨著人們對(duì)生物體認(rèn)識(shí)的不斷深入，生物傳感器必將在市場(chǎng)上開辟出一片新的天地。
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The Recent Research And Application Of Biosensor
Abstract: In this article, the recent research progress and application of biosensors ,especially the micro- biosensors, are reviewed, and the prospect of biosensors development is also prognosticated. Biosensors are made up of bioelectrode , using immobile organism as sensitive material for molecule recognition, together with oxygen-electrode, membrane -eletrode and fuel-electrode. Biosensors are broadly used in zymosis industry, environment monitor, food monitor and clinic medicine. Fast, accurate, facilitate as biosensors is,there will be an excellent prospect for biosensors in the market
Keywords:Biosensor, Zymosis -Industry, Environment-Monitor