摘要：本文較為系統(tǒng)地概述了核酸探針檢測(cè)技術(shù)、利用引物的PCR技術(shù)、DNA序列分析技術(shù)和電泳分離及顯示技術(shù)的研究進(jìn)展，并探討了這些技術(shù)在環(huán)境污染研究中的應(yīng)用及其方向，表明，這些被認(rèn)為是重要的微生物分子技術(shù)，在探索微生物與污染環(huán)境之間的相互關(guān)系中發(fā)揮了重要作用，推進(jìn)了污染環(huán)境微生物研究的發(fā)展*
關(guān)鍵詞：微生物 分子生物學(xué) 環(huán)境污染
在新世紀(jì)之初，由于全球人增地減、資源匱乏，人類對(duì)環(huán)境的依賴性愈來(lái)愈強(qiáng)烈。隨著人類的生活要求和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的迅速發(fā)展，大量人工合成的并難以被天然微生物迅速降解轉(zhuǎn)化的污染性化合物進(jìn)入到自然環(huán)境中，成為嚴(yán)重威脅人類及其他生物正常生存發(fā)展的土壤污染區(qū)，污染還導(dǎo)致資源環(huán)境中生物重組，使物種的分布與多度均發(fā)生深刻的變化，致使系統(tǒng)變得越來(lái)越脆弱，降低了生態(tài)系統(tǒng)的功能穩(wěn)定性。因此，治理破壞環(huán)境生態(tài)的各種污染，已成為世界各國(guó)普遍關(guān)注并努力攻克的熱點(diǎn)問題。最近20年間，以核酸技術(shù)為主要內(nèi)容的分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，在揭示生物多樣性的研究中提供了新的方法論，開拓了分子生物學(xué)與生態(tài)學(xué)交叉領(lǐng)域。通過(guò)檢測(cè)生物自然種群DNA序列多態(tài)性，鑒定個(gè)體的基因型，在基因水平評(píng)價(jià)種群遺傳分化，并在分子水平闡述分子適應(yīng)等生態(tài)問題的機(jī)制，更好地揭示生物與環(huán)境之間的生態(tài)學(xué)意義，為污染環(huán)境的生物修復(fù)提供理論依據(jù)。
1. 微生物分子生態(tài)學(xué)技術(shù)
1.1 核酸探針檢測(cè)技術(shù)
以核酸分子雜交技術(shù)為核心，利用探針分析DNA序列及片段長(zhǎng)度多態(tài)性*探針是能與特定核苷酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知核酸片段，它可以是長(zhǎng)探針（100～1000bp），也可以是短核苷酸片段（10～50bp），可以是從RNA制備cDNA探針，也可以是PCR產(chǎn)物或人工合成的寡核苷酸探針。根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，被標(biāo)記（放射性或非放射性的）的核苷酸探針以原位雜交、Southern(印跡雜交、斑點(diǎn)印跡和狹線印跡雜交等不同的方法，可直接用來(lái)探測(cè)溶液中、細(xì)胞組織內(nèi)或固定在膜上的同源核酸序列)由于核酸分子雜交的高度特異性及檢測(cè)方法的高度靈敏性，使得核酸分子雜交技術(shù)廣泛應(yīng)用于對(duì)環(huán)境中的生物的檢測(cè)，定性、定量分析它們的存在、分布、豐度和適應(yīng)性等研究目標(biāo)。
基因探針方法學(xué)利用了DNA能變性和重退火的特性。要做一個(gè)基因探針，所研究的這個(gè)基因的DNA順序必須清楚。這個(gè)基因?qū)σ惶囟ǖ奈⑸锓N可能是獨(dú)特的，在這種情況下，這一DNA順序就有利于檢出那種微生物體�；蛘�，這個(gè)基因可能編碼一種某一代謝途徑獨(dú)特的酶，從這樣一種序列構(gòu)建出的基因探針就有可能指示土壤或水樣品中一群細(xì)菌的潛在活性。這類探針可定義為功能性基因探針。例如，由編碼固氮作用的酶的DNA序列可做成基因探針，這樣的探針就可以用于測(cè)估特定的土壤中是否含有攜帶固氮基因的細(xì)菌。隨后，還可以構(gòu)建另外的探針，用以測(cè)定這些機(jī)體實(shí)際上是根瘤菌屬或固氮螺菌屬的一些種，或者是藍(lán)細(xì)菌。這一基因甚至可能對(duì)所有的細(xì)菌來(lái)說(shuō)是通用的，因而使檢出所有已知細(xì)菌成為可能。
1.2 利用引物的PCR技術(shù)
在分子生態(tài)學(xué)中，根據(jù)擴(kuò)增的模板、引物序列來(lái)源及反應(yīng)條件的不同可將PCR技術(shù)分為以下幾種：1）反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（Rt-PCR），是在mRNA反轉(zhuǎn)錄之后進(jìn)行的PCR擴(kuò)增，可以用來(lái)分析不同生長(zhǎng)時(shí)期的mRNA表達(dá)狀況的相關(guān)性)。2）競(jìng)爭(zhēng)PCR（C-PCR），是一種定量PCR，通過(guò)向PCR反應(yīng)體系中加入人工構(gòu)建的帶有突變的競(jìng)爭(zhēng)模板、控制競(jìng)爭(zhēng)模板的濃度來(lái)確定目的模板的濃度，對(duì)目的模板作定量研究。3）擴(kuò)增的rDNA限制酶切分析技術(shù)（ARDRA），是美國(guó)最新發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)現(xiàn)代生物鑒定技術(shù)，它依據(jù)原核生物rDNA序列的保守性，將擴(kuò)增的rDNA片段進(jìn)行酶切，然后通過(guò)酶切圖譜來(lái)分析菌間的多樣性。4）隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)（RAPD），是以一個(gè)通常為10堿基的寡核苷酸序列為引物，對(duì)基因組DNA隨機(jī)擴(kuò)增來(lái)鑒別多態(tài)性DNA的過(guò)程，RAPD分析不需要生物DNA序列，而且DNA用量少，無(wú)種族特異性，不需要制備克隆、探針標(biāo)記和分子雜交等，是一種易推廣應(yīng)用的技術(shù)。
1.3 DNA序列分析
最充分揭示DNA多樣性的方法是DNA序列分析)尤其是熒光標(biāo)記的核酸自動(dòng)測(cè)序儀的普遍使用，同時(shí)隨著分子信息學(xué)的發(fā)展，已有許多功能基因及專門的’DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)軟件供序列比較，使核基因的序列分析可揭示更高水平多態(tài)性)生態(tài)學(xué)上用的最多的是“通用”引物擴(kuò)增DNA某些基因（如DNA）的DNA片段，隨后用通用引物直接測(cè)序)。
1.4 電泳分離及顯示方法
一般在核酸技術(shù)中，都會(huì)用到電泳分離方法：瓊脂糖凝膠電泳并用溴乙錠染色方法；或聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染的方法。相比之下，后者靈敏度高，每次電泳只要加1～3uL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，一次擴(kuò)增可多次電泳，但操作要比瓊脂糖凝膠電泳復(fù)雜得多。
1.5 生物芯片
近年來(lái)，高通量的DNA序列篩選推動(dòng)了生物芯片技術(shù)的發(fā)展。生物芯片是指一套DNA探針，通常是從cDNA或基因組克隆純化的PCR產(chǎn)物，存放在固體支持物（一般用顯微鏡載玻片）上，其密度可達(dá)每平方厘米幾百個(gè)點(diǎn)。芯片主要用于基因表達(dá)。這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)在制藥工業(yè)中用于查看藥物反應(yīng)。然而，這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用看來(lái)是無(wú)止境的。在環(huán)境微生物學(xué)中，生物芯片具有一次試驗(yàn)就可篩選飲用給水中幾百病原體的潛在能力。
2. 分子生態(tài)學(xué)技術(shù)在環(huán)境污染研究中的應(yīng)用
2.1 污染環(huán)境微生物種群動(dòng)態(tài)的分析
在微生物系統(tǒng)分析中，16SrRNA:DNA的比率是檢測(cè)復(fù)雜的微生物種群特定成員代謝活動(dòng)的有效參數(shù)。核酸可以通過(guò)以專一性和通用型探針分別與直接從微生物樣品中分離的總核苷酸進(jìn)行雜交，可獲得相對(duì)于總16SrRNA的特定16SrRNA數(shù)量，其相對(duì)豐度可以用與專一性探針和通用型探針雜交的殘余放射性強(qiáng)度之比來(lái)表示。在穩(wěn)定的條件下，某種微生物的RNA:DNA比率是與它生長(zhǎng)率呈正相關(guān)。利用定量點(diǎn)漬雜交求RNA:DNA的比率時(shí)，具有很低豐度的rRNA序列也可以被定量，但由于不同種生物細(xì)胞內(nèi)有不同數(shù)量的核糖體，甚至同一種細(xì)胞內(nèi)在不同時(shí)期核糖體數(shù)目也不同，所以rRNA的豐度不能直接用于表示某類微生物細(xì)胞數(shù)的多少，但可以代表特定種群的相對(duì)生理活性，這對(duì)研究生態(tài)系統(tǒng)功能多樣性有重要的意義。
2.2 污染環(huán)境微生物適應(yīng)性———質(zhì)粒的分子生態(tài)效應(yīng)
在污染環(huán)境中，微生物通過(guò)調(diào)節(jié)其結(jié)構(gòu)和生理狀況，或者形成能在自然環(huán)境中廣泛傳播的質(zhì)粒，完善那些降解異生物質(zhì)酶系的遺傳基因，以適應(yīng)日益污染的環(huán)境!這種對(duì)環(huán)境的遺傳適應(yīng)是進(jìn)化的機(jī)制!探索自然種群對(duì)環(huán)境的調(diào)整與適應(yīng)的遺傳基礎(chǔ)，特別是微生物對(duì)環(huán)境污染物的反應(yīng)，是近代微生物生態(tài)學(xué)和分子生態(tài)學(xué)共同關(guān)注的焦點(diǎn)!許多研究表明，細(xì)菌對(duì)環(huán)境中的特異性限制因子的應(yīng)答能力一般是由質(zhì)粒控制的!質(zhì)粒在為宿主細(xì)胞提供遺傳多樣性及其利用大范圍生態(tài)位的適應(yīng)中起著非常重要的作用。因此，對(duì)降解性質(zhì)粒特征及其在環(huán)境污染物凈化或解毒過(guò)程的分子生態(tài)學(xué)進(jìn)行研究，具有實(shí)踐上的重要意義。
質(zhì)粒為細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行復(fù)制的自主復(fù)制子，是染色體外的遺傳物質(zhì)，核酸技術(shù)在分子生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用成為質(zhì)粒研究的新動(dòng)力。質(zhì)粒的產(chǎn)生不僅會(huì)引起種的多樣性，更主要的是它有足夠的靈活遺傳力去發(fā)展它們重組質(zhì)粒所攜帶的代謝基因，表現(xiàn)不同的生態(tài)功能，因此，質(zhì)粒的基因很自然地成為污染環(huán)境的微生物分子生態(tài)學(xué)研究的對(duì)象!近年來(lái)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多降解脂肪烴、芳香烴、多環(huán)芳烴以及它們的氧化產(chǎn)物、萜烯、生物堿、氯代芳烴和多氯聯(lián)苯的質(zhì)粒基因，其中大多來(lái)自假單胞菌屬等：微生物分子生態(tài)學(xué)技術(shù)及其在環(huán)境污染研究中的應(yīng)用假單胞菌屬、脫氮產(chǎn)堿桿菌或富營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌、紅球菌的菌株，還有分支桿菌屬的多個(gè)種。
3.結(jié)語(yǔ)
從污染環(huán)境微生物分子生態(tài)學(xué)的研究進(jìn)程可見，分子生態(tài)學(xué)技術(shù)的應(yīng)用不僅擴(kuò)大了環(huán)境微生物的研究對(duì)象，促進(jìn)了微生物結(jié)構(gòu)生態(tài)學(xué)研究，更重大的突破是有助于更深入、更多地了解生態(tài)學(xué)過(guò)程，使得以功能基因?yàn)榛A(chǔ)的功能生態(tài)學(xué)研究成為今后污染生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的新方向$特別對(duì)污染脅迫下的微生物，研究功能基因在環(huán)境中的表達(dá)調(diào)控，可更真實(shí)、準(zhǔn)確地揭示微生物的生態(tài)關(guān)系，明確生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能，即生態(tài)系統(tǒng)中一系列基因的相互作用。
在自然界中存在大量可挖掘和利用的具有抗逆性、高降解能力等優(yōu)異基因的微生物資源，但通過(guò)傳統(tǒng)的方法卻不能分離甚至檢測(cè)，在分子生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域可以克服技術(shù)上的障礙，檢測(cè)更多的微生物種群，并可在分子水平對(duì)其生態(tài)功能進(jìn)行分析、操作$目前，很多氯代有機(jī)物、多氯聯(lián)苯、萘、菲、蒽、芘、菊酯類等污染物的部分降解基因已被克隆并已闡明其序列結(jié)構(gòu)和功能，在此基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步探索自然種群對(duì)環(huán)境的調(diào)整與適應(yīng)的遺傳基礎(chǔ)，從功能上闡明分子適應(yīng)及生態(tài)學(xué)過(guò)程的分子機(jī)理，進(jìn)一步通過(guò)基因工程操作將某些不同生物體中控制有用的生物降解途徑或酶的微生物異化代謝基因帶到同一寄主中，按照設(shè)計(jì)的生物代謝途徑運(yùn)行，以實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境污染物或特定毒物的降解，從而顯著地或徹底地改善微生物在污染環(huán)境修復(fù)中的功能。
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