因限制性?xún)?nèi)切酶在DNA鏈上的切口是以特異序列為基礎(chǔ)的,核苷酸序列不同的DNA,經(jīng)酶切后就會(huì)產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的DNA片段,由此而構(gòu)成獨(dú)特的酶切圖譜。因此，DNA物理圖譜是DNA分子結(jié)構(gòu)的特征之一。DNA是很大的分子,由限制酶產(chǎn)生的用于測(cè)序反應(yīng)的DNA片段只是其中的極小部分,這些片段在DNA鏈中所處的位置關(guān)系是應(yīng)該首先解決的問(wèn)題,故DNA物理圖譜是順序測(cè)定的基礎(chǔ),也可理解為指導(dǎo)DNA測(cè)序的藍(lán)圖。廣義地說(shuō),DNA測(cè)序從物理圖譜制作開(kāi)始,它是測(cè)序工作的第一步。制作DNA物理圖譜的方法有多種,這里選擇一種常用的簡(jiǎn)便方法──標(biāo)記片段的部分酶解法,來(lái)說(shuō)明圖譜制作原理。
用部分酶解法測(cè)定DNA物理圖譜包括兩個(gè)基本步驟:
(1)完全降解：選擇合適的限制性?xún)?nèi)切酶將待測(cè)DNA鏈(已經(jīng)標(biāo)記放射性同位素)完全降解,降解產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離后進(jìn)行自顯影,獲得的圖譜即為組成該DNA鏈的酶切片段的數(shù)目和大小。
(2)部分降解：以末端標(biāo)記使待測(cè)DNA的一條鏈帶上示蹤同位素,然后用上述相同酶部分降解該DNA鏈,即通過(guò)控制反應(yīng)條件使DNA鏈上該酶的切口隨機(jī)斷裂,而避免所有切口斷裂的完全降解發(fā)生。部分酶解產(chǎn)物同樣進(jìn)行電泳分離及自顯影。比較上述二步的自顯影圖譜,根據(jù)片段大小及彼此間的差異即可排出酶切片段在DNA鏈上的位置。下面是測(cè)定某組蛋白基因DNA物理圖譜的詳細(xì)說(shuō)明。
該基因全長(zhǎng)5900bp,用限制酶HpaⅡ完全降解該DNA可產(chǎn)生五個(gè)大小不等的片段,電泳分離并參照已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA帶,得知這些片段的大小分別為1930、1690、1020、950和310bp。不難推測(cè)該DNA上有四個(gè)HpaⅡ切口,但切口的位置和這五個(gè)片段在完整基因中的排列順序此時(shí)尚無(wú)法知道。接著將末端標(biāo)記的該DNA片段進(jìn)行HpaⅡ的部分降解,由于各切口隨機(jī)斷裂,產(chǎn)生的片段數(shù)顯然會(huì)多于完全降解產(chǎn)物。但電泳后的自顯影圖上只可能出現(xiàn)末端標(biāo)記的DNA片段。若以待測(cè)DNA在左端為標(biāo)記處,那么自顯影圖上將呈現(xiàn)4210、3260、2950和1020bp四條帶。其中最小片段（1020bp）與完全降解產(chǎn)物為同一片段，它應(yīng)定位于該基因的左端；而最大片段（4210bp）與完整基因（5900bp）之差的片段（1690bp）無(wú)疑應(yīng)定位于該基因的右端；余下的三個(gè)片段（1930、930和310bp）的定位，根據(jù)部分酶解的相鄰片段之差很易確定。據(jù)此推出的這五個(gè)片段在該基因上的排列順序是（左→右）:1020-1930-310-950-1690。物理圖譜與DNA測(cè)序的原理頗為相似，二者是通過(guò)片段長(zhǎng)度來(lái)推測(cè)位置，所不同的是測(cè)序確定核苷酸（堿基）的位置，而此處是確定某個(gè)片段的位置。DNA物理圖譜測(cè)定后,便可對(duì)每一酶切片段進(jìn)行核苷酸順序分析。在測(cè)定了所有片段的DNA順序后,根據(jù)物理圖譜將各片段"拼湊"起來(lái)就得出了待測(cè)DNA鏈的全部核苷酸順序�；虻娜樞驕y(cè)定才是我們要達(dá)到目的,一般人類(lèi)基因的長(zhǎng)度都在10Kb以上,巨大基因可長(zhǎng)達(dá)200Kb,要完成基因的全順序測(cè)定需進(jìn)行大量的工作。完成這些工作可采取多種不同的方法,但其基本思路是一致的,即在確定物理圖譜的基礎(chǔ)上,再進(jìn)行DNA順序測(cè)定。
