1980年底Gordon等人首次將克隆的基因注入小鼠受精卵原核，然后移植于假孕的母鼠輸卵管,培育出第1個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。這種將外源性基因用實(shí)驗(yàn)方法插入動(dòng)物生殖細(xì)胞的基因組而獲得具有插入基因特性，并能正常繁衍的動(dòng)物稱為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 ( transgenicanimals)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是生物學(xué)領(lǐng)域最新重大進(jìn)展之一，已能滲透到生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、畜牧學(xué)等學(xué)科的廣泛領(lǐng)域。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物已成為探討基因調(diào)控機(jī)理、致癌基因作用和免疫系統(tǒng)反應(yīng)的有力工具。同時(shí)人類遺傳病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的建立，為遺傳病的基因治療打下堅(jiān)實(shí)的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
轉(zhuǎn)基因技術(shù)涉及外源基因的組建、載體、受體、基因?qū)爰夹g(shù)、供轉(zhuǎn)基因胚胎發(fā)育的體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動(dòng)物等方面的內(nèi)容。
一、轉(zhuǎn)移基因
(一)轉(zhuǎn)移基因的原理：轉(zhuǎn)基因技術(shù)的理論基礎(chǔ)在于各種生物的遺傳密碼都是統(tǒng)一的。都是以3個(gè)堿基決定一個(gè)氨基酸這樣的密碼形式貯存在DNA鏈上，各物種間形狀的不同僅僅是由于DNA上的四種核苷酸排列次序的不同，同時(shí)各種生物從DNA到蛋白質(zhì)合成都服從“中心法則”,當(dāng)一個(gè)物種的細(xì)胞內(nèi)加入另一物種或人工合成的DNA(即基因)后就可能產(chǎn)生新的性狀。
(二)基因的獲得：取自現(xiàn)有的生物體如病毒、細(xì)菌、體細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的DNA,用限制內(nèi)切酶或外切酶把DNA切割成若干小段,然后再把這些小段利用連接酶分別放入載體中,并建成載體克隆。載體通常是一種獨(dú)立的，能自我復(fù)制的遺傳物質(zhì)，如質(zhì)粒、某些噬菌體和病毒均可作為載體�；虻钠瑪嗫呻S載體復(fù)制，有時(shí)亦可表達(dá)，用DNA 或抗體探針做分子雜交試驗(yàn)或ELISA試驗(yàn)篩選出帶有理想基因的克隆,再把理想基因載體放入大腸桿菌等宿主細(xì)胞中擴(kuò)大、增殖,或采用PCR的方法擴(kuò)增。再對(duì)擴(kuò)增的DNA片斷進(jìn)行適當(dāng)修飾,例如將一個(gè)單一的基因與經(jīng)選擇的啟動(dòng)子重組合，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)移，或?qū)⑻囟ǖ目刂菩蛄羞B接到目的基因的結(jié)構(gòu)序列上，從而創(chuàng)造1個(gè)新的重組基因,然后再進(jìn)行轉(zhuǎn)移。
理想基因也可用人工合成的辦法獲得，要合成一特定的基因，就是要合成具有一定排列順序的DNA，DNA上四種堿基的配對(duì)是非常嚴(yán)格的,腺嘌呤(A)必定和胸腺嘧啶(T) 配對(duì)，鳥嘌呤(G)必定和胞嘧啶(C)配對(duì)，由于蛋白質(zhì)合成不是直接以DNA作為模板,而是以DNA的副本mRNA作為模板，在RNA中，用尿嘧啶(U)代替了胸腺嘧啶(T)。
二、基因轉(zhuǎn)移的受體細(xì)胞
研究轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備，首先要考慮用何種轉(zhuǎn)基因受體細(xì)胞。選擇合適的受體細(xì)胞和可行的基因?qū)胪緩�，是該技術(shù)成功的前提�；蜣D(zhuǎn)移的受體細(xì)胞必須是全能細(xì)胞，全能細(xì)胞隨著細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育，可以把其中的基因組貯存的全部遺傳信息擴(kuò)大到生物體所有的細(xì)胞中。除此以外至少是多能細(xì)胞。滿足轉(zhuǎn)基因動(dòng)物需要的受體細(xì)胞有以下幾種。
(一)原生殖細(xì)胞：禽類的原生殖細(xì)胞容易分離、培養(yǎng)和冷凍，所以，這種受體細(xì)胞在禽類動(dòng)物較易實(shí)現(xiàn)。
(二)配子：配子能把自身攜帶的基因組全部信息和外源插入基因序列，完整地貢獻(xiàn)給合子。由于精子可用作有效的轉(zhuǎn)移載體，所以，可以精子作為目的基因的受體。較多的是用重組病毒直接感染精子，精子即可把外源基因傳到合子。
(三)受精卵或胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)：精卵結(jié)合形成的單細(xì)胞受精卵，是最常用的外源基因轉(zhuǎn)移的受體；受精后的早期胚胎及囊胚期稍后的胚胎含有的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，該細(xì)胞團(tuán)內(nèi)含有未分化的胚胎干細(xì)胞，也可認(rèn)為是全能的，或至少是多能性的，所以，用該時(shí)期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或囊胚期的細(xì)胞作為外源基因的受體細(xì)胞，也可望達(dá)到基因轉(zhuǎn)移的目的。但這種情況下制備的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物多為嵌合體。
三、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的準(zhǔn)備
本文主要敘述制備轉(zhuǎn)基因鼠的實(shí)驗(yàn)程序。
(一)不育雄性公鼠:結(jié)扎公鼠與母鼠交配以后產(chǎn)生假孕母鼠。受結(jié)扎的公鼠需8周以上，對(duì)種系無(wú)特殊要求。在正式實(shí)驗(yàn)前，結(jié)扎公鼠需與性成熟的雌性小鼠交配，反復(fù)交配兩次或三次，經(jīng)檢查雌體有陰道栓，但均不懷孕產(chǎn)仔，則證明結(jié)扎成功。結(jié)扎公鼠使母鼠產(chǎn)生陰道栓的能力可維持2年。值得注意的是，如結(jié)扎公鼠與母鼠交配4～6 次均不能產(chǎn)生陰道栓，則該公鼠必須更換。
(二)假孕雌性母鼠:作為獲得外源基因即轉(zhuǎn)基因胚胎的養(yǎng)母，要求6周齡至5 個(gè)月較合適，對(duì)種系無(wú)特殊要求。其生殖系統(tǒng)的生理狀態(tài)應(yīng)與移進(jìn)胚胎的發(fā)育階段同步化，從而為移植胚胎提供著床和繼續(xù)發(fā)育的生理?xiàng)l件。將選好的成年健康雌性個(gè)體與不育雄性個(gè)體進(jìn)行交配，時(shí)間應(yīng)與供體(取受精卵的雌體)同時(shí)進(jìn)行。一般為下午4點(diǎn)鐘合籠,次日晨選有陰道栓的待用。
(三)取受精卵的雌性母鼠：如果無(wú)特殊遺傳背景的要求，一般用雜交F1受精卵較為理想。因雜交F1代胚胎的發(fā)育能力和對(duì)外環(huán)境的耐受能力都較強(qiáng)，有益于提高移植胚胎的出生率。在對(duì)遺傳背景有特殊要求的情況下，供卵母鼠需選擇種系，例如把一種鼠的等位基因轉(zhuǎn)移到另一種不同等位基因的種系，這種卵供體母鼠必須有特定的遺傳背景，因此需用純系鼠。在實(shí)際操作中，一般用4～6周母鼠作為超排卵供體，3～4周母鼠產(chǎn)卵更多但卵細(xì)胞膜脆性較大，在處理過(guò)程中易破裂，而6周以后母鼠產(chǎn)卵逐漸減少。
(四)與卵供體母鼠交配的正常公鼠：公鼠性成熟約在6～8周，不同種系有些區(qū)別。每個(gè)作超排卵的母鼠與一只公鼠交配，次日上午檢查是否有陰道栓并作記錄。如兩次以上都不能使母鼠有陰道栓，或總的陰道栓產(chǎn)生率低于60～80％，則需更換公鼠。
四、基因?qū)氲姆椒?br />(一)顯微注射法：在顯微鏡下，可借助顯微操作儀，將毛細(xì)玻璃管直接插入受精卵的雄原核中(較大的原核),注入特定的外源基因,即為基因顯微注射法。下面把利用顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因鼠的方法和步驟簡(jiǎn)述如下。
1. 超數(shù)排卵(超排)與取卵
(1)超數(shù)排卵：在雌性動(dòng)物發(fā)情周期的某一階段,用促性腺激素促使卵巢里大量卵泡成熟并排出，稱超數(shù)排卵。影響母鼠超排因素有母鼠的性成熟程度、營(yíng)養(yǎng)、體重及母鼠種系。超排的最佳時(shí)間隨種系不同而異,一般在3～5周，超過(guò)6周超排卵數(shù)明顯減少。
在實(shí)際操作中常取4～6周齡的母鼠作超排卵供體，腹腔注射孕馬血清(PMS) 和人絨毛膜促性腺激素(hCG)誘導(dǎo)母鼠排卵。PMS模擬卵泡刺激素(FSH)作用，hCG模擬黃體生成素(LH)的作用。二者注射時(shí)間間隔為42～48h，排卵發(fā)生在注射hCG后10～13h,注射劑量為每鼠5～10u。為了實(shí)驗(yàn)方便，常在下午注射PMS，隔日同一時(shí)間注射hCG，注射hCG 后每只母鼠置于一個(gè)單獨(dú)飼養(yǎng)的正常公鼠籠內(nèi)，次日晨檢查陰道栓。
(2)取卵：用頸椎脫臼法處死有陰道栓的雌鼠，把完整的輸卵管帶一小段子宮剪下,置于PBS平衡鹽溶液中，在解剖鏡下找出輸卵管傘部，用帶4號(hào)針頭的注射器將受精卵沖出，立即將卵子換至新鮮培養(yǎng)液內(nèi)洗滌3～4次即可用于顯微注射。
2. 注射外源DNA：顯微注射需用顯微操作儀，用來(lái)控制顯微持卵針和顯微注射針。持卵針是顯微注射時(shí)固定受精卵的細(xì)玻璃管，管口平滑，通過(guò)一注射器控制持卵針，使其吸住要進(jìn)行注射的受精卵。用來(lái)注射外源DNA的細(xì)注射針管表面平滑，尖端鋒利,便于注射時(shí)穿過(guò)透明帶、細(xì)胞膜等。取已制備好的受精卵細(xì)胞和外源DNA懸液,在倒置顯微鏡下做顯微注射。注射時(shí)先用持卵針吸住受精卵，再用注射針吸取外源DNA懸液,然后推動(dòng)注射針，使其刺入受精卵的雄原核，將DNA注入。注射完畢，慢慢抽出注射針,將受精卵放入新的培養(yǎng)液中，使其恢復(fù)。一般50～80％的受精卵在顯微注射后仍保持健康。
3. 注射后受精卵(或胚胎)的移植：注射后單細(xì)胞至桑椹胚的卵(受精后0.5天到3.5天)移植至受孕后的0.5天的假孕鼠的輸卵管，輸卵管移植需用被透明帶包裹的卵。也可將注射有外源DNA的受精卵或桑椹胚體外培養(yǎng)至囊胚，再行移植。顯微注射后3.5天的囊胚移植至受孕后2.5天的假孕鼠子宮，子宮移植不需要有透明帶。
此法的優(yōu)點(diǎn)是，在一定設(shè)備和經(jīng)驗(yàn)條件下，實(shí)驗(yàn)過(guò)程大為簡(jiǎn)化；任何DNA 順序都可直接導(dǎo)入原核內(nèi),導(dǎo)入的外源DNA在卵裂前與受體基因組整合,其缺點(diǎn)在于導(dǎo)入的外源DNA通常以多拷貝串聯(lián)的形式隨機(jī)地整合于受體基因組中，妨礙其表達(dá)的正常調(diào)節(jié)。
(二)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法：以逆轉(zhuǎn)錄病毒作載體， 把重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體DNA包裝成高滴度病毒顆粒，感染發(fā)育早期的胚胎，將外源基因?qū)胨拗鞯娜旧w內(nèi)的方法稱為逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法。此法操作簡(jiǎn)單，可通過(guò)注射將重組病毒轉(zhuǎn)移到囊胚腔內(nèi)，也可將去透明帶的胚胎與分泌重組病毒顆粒的細(xì)胞共培養(yǎng)，以達(dá)到將外源DNA 轉(zhuǎn)移到胚胎中去的目的。
這一方法的優(yōu)點(diǎn)是，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒可同時(shí)感染大量胚胎。感染后的整合率高；外源DNA在受體細(xì)胞基因組中的整合通常是單拷貝的；不需要昂貴的顯微注射設(shè)備。本法的缺點(diǎn)是，由于選用的受體是早期胚胎，不是受精卵，致使外源DNA 在動(dòng)物各種組織中的分布不均,不易整合到生殖細(xì)胞中；由于病毒衣殼大小有限,限制了被導(dǎo)入的外源 DNA的大小，一般不超過(guò)15Kb。
(三)胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法：囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)含有未分化的胚胎干細(xì)胞。體外建株的胚胎干細(xì)胞稱為EK細(xì)胞(embryonic karyotype cell)或(embryonic stem cell)。 如果將EK細(xì)胞移植到正常發(fā)育的囊胚腔中，它們能很快地與受體的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)聚集在一起，參與正常的胚胎發(fā)育。用重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體感染EK 細(xì)胞， 再將此EK細(xì)胞移植入受體囊胚腔，可發(fā)育成攜帶著特定外源DNA的個(gè)體。
采用這一方法的優(yōu)點(diǎn)是，外源DNA的整合率高； 整合在生殖細(xì)胞中的比例也很高。缺點(diǎn)是，EK細(xì)胞株不易建立，長(zhǎng)期培養(yǎng)后出現(xiàn)細(xì)胞分化現(xiàn)象；生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物都是嵌合體。
(四)精子載體法 將外源DNA與精子一起孵育，精子可捕獲外源DNA，并通過(guò)受精過(guò)程將外源DNA導(dǎo)入受精卵。此法不僅可免去復(fù)雜而昂貴的設(shè)備， 且可省去不少繁雜的操作和條件準(zhǔn)備。但該法有些結(jié)果不能重復(fù)。
此外，還有一些其它的方法，都有不同的優(yōu)缺點(diǎn)。
五、轉(zhuǎn)基因鼠的檢測(cè)
待假孕母鼠產(chǎn)出幼仔后,可用幼鼠尾巴提取DNA;對(duì)于一些基因調(diào)控研究,需要盡快獲得信息而暫不需保留轉(zhuǎn)基因鼠，從胎鼠組織或幼鼠尾巴提取的DNA,可用PCR、Dot blot
(斑點(diǎn)雜交)、Southern blot(Southern轉(zhuǎn)移)等多種方法分析以確定是否轉(zhuǎn)基因鼠。
六、基因轉(zhuǎn)移后的存在方式及表達(dá)
(一)外源基因?qū)牒蟮拇嬖诜绞剑和庠椿虮粚?dǎo)入受體細(xì)胞后，在受體細(xì)胞內(nèi)的存在方式有三種：
1. 非同源重組。大多數(shù)外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞后,與受體細(xì)胞染色體的某一位點(diǎn)隨機(jī)整合，這樣可帶來(lái)正�；虻牟迦搿⑷笔�、易位等突變。
2. 同源重組。導(dǎo)入的外源DNA與受體細(xì)胞染色體的DNA 通過(guò)順序取代或順序插入實(shí)現(xiàn)同源重組。通過(guò)同源重組有可能導(dǎo)致受體細(xì)胞正常的基因發(fā)生突變，當(dāng)然，也有可能代替原來(lái)的有遺傳缺陷的遺傳基因，從而糾正遺傳缺陷。
3. 游離存在。外源基因沒(méi)有整合到受體細(xì)胞中,而是以附加體的形式游離在受體細(xì)胞內(nèi)，能自我復(fù)制，并能100％的傳給下一代。
(二)外源基因?qū)牒蟮谋磉_(dá)：外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞后能否表達(dá)，是受許多因素影響的。
1. 外源基因本身的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。
2. 附帶的原核載體順序。研究發(fā)現(xiàn)，原核載體的存在對(duì)α-甲胎蛋白、β- 珠蛋白等基因的表達(dá)具有明顯的抑制作用，而對(duì)免疫球蛋白和膠原蛋白基因的抑制不明顯。
3. 染色體位置。 外源基因在受體動(dòng)物細(xì)胞染色體上整合部位的基因環(huán)境對(duì)外源基因表達(dá)的影響很大。
4. 甲基化。被轉(zhuǎn)移的基因容易甲基化而失活。
外源基因在受體細(xì)胞中的表達(dá)方式表現(xiàn)為組織特異性和發(fā)育階段特異性。組織特異性表達(dá)是由于某些調(diào)節(jié)元件如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的作用造成的。比如，免疫球蛋白基因只在B細(xì)胞中表達(dá)，原因是免疫球蛋白基因的啟動(dòng)子只存在于B淋巴細(xì)胞內(nèi)，這是一類只在專一細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子；另有一類可在多種組織細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子，比如，人生長(zhǎng)激素基因分別在肝與腎、淋巴器官和肌肉中表達(dá)。發(fā)育階段特異性表達(dá)是指轉(zhuǎn)基因在個(gè)體發(fā)育中的表達(dá)具有嚴(yán)格的時(shí)空特性，受到精細(xì)的調(diào)控。
