同位素示蹤法（isotopic tracer method）是利用放射性核素作為示蹤劑對研究對象進(jìn)行標(biāo)記的微量分析方法，示蹤實驗的創(chuàng)建者是Hevesy。Hevesy于1923年首先用天然放射性212Pb研究鉛鹽在豆科植物內(nèi)的分布和轉(zhuǎn)移。繼后Jolit和Curie于1934年發(fā)現(xiàn)了人工放射性，以及其后生產(chǎn)方法的建立（加速器、反應(yīng)堆等），為放射性同位素示蹤法的更快的發(fā)展和廣泛應(yīng)用提供了基本的條件和有力的保障。
一、同位素示蹤法基本原理和特點
同位素示蹤所利用的放射性核素（或穩(wěn)定性核素）及它們的化合物，與自然界存在的相應(yīng)普通元素及其化合物之間的化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)是相同的，只是具有不同的核物理性質(zhì)。因此，就可以用同位素作為一種標(biāo)記，制成含有同位素的標(biāo)記化合物（如標(biāo)記食物，藥物和代謝物質(zhì)等）代替相應(yīng)的非標(biāo)記化合物。利用放射性同位素不斷地放出特征射線的核物理性質(zhì)，就可以用核探測器隨時追蹤它在體內(nèi)或體外的位置、數(shù)量及其轉(zhuǎn)變等，穩(wěn)定性同位素雖然不釋放射線，但可以利用它與普通相應(yīng)同位素的質(zhì)量之差，通過質(zhì)譜儀，氣相層析儀，核磁共振等質(zhì)量分析儀器來測定。放射性同位素和穩(wěn)定性同位素都可作為示蹤劑（tracer），但是，穩(wěn)定性同位素作為示蹤劑其靈敏度較低，可獲得的種類少，價格較昂貴，其應(yīng)用范圍受到限制；而用放射性同位素作為示蹤劑不僅靈敏度，測量方法簡便易行，能準(zhǔn)確地定量，準(zhǔn)確地定位及符合所研究對象的生理條件等特點：
1.靈敏度高
放射性示蹤法可測到10-14－10-18克水平，即可以從1015個非放射性原子中檢出一個放射性原子。它比目前較敏感的重量分析天平要敏感108-107倍，而迄今最準(zhǔn)確的化學(xué)分析法很難測定到10-12克水平。
2.方法簡便
放射性測定不受其它非放射性物質(zhì)的干擾，可以省略許多復(fù)雜的物質(zhì)分離步驟，體內(nèi)示蹤時，可以利用某些放射性同位素釋放出穿透力強(qiáng)的r射線，在體外測量而獲得結(jié)果，這就大大簡化了實驗過程，做到非破壞性分析，隨著液體閃爍計數(shù)的發(fā)展，14C和3H等發(fā)射軟β射線的放射性同位素在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)實驗中得到越來越廣泛的應(yīng)用。
3.定位定量準(zhǔn)確
放射性同位素示蹤法能準(zhǔn)確定量地測定代謝物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)變,與某些形態(tài)學(xué)技術(shù)相結(jié)合（如病理組織切片技術(shù)，電子顯微鏡技術(shù)等），可以確定放射性示蹤劑在組織器官中的定量分布，并且對組織器官的定位準(zhǔn)確度可達(dá)細(xì)胞水平、亞細(xì)胞水平乃至分子水平。
4.符合生理條件
在放射性同位素實驗中，所引用的放射性標(biāo)記化合物的化學(xué)量是極微量的，它對體內(nèi)原有的相應(yīng)物質(zhì)的重量改變是微不足道的，體內(nèi)生理過程仍保持正常的平衡狀態(tài)，獲得的分析結(jié)果符合生理條件，更能反映客觀存在的事物本質(zhì)。 放射性同位素示蹤法的優(yōu)點如上所述，但也存在一些缺陷，如從事放射性同位素工作的人員要受一定的專門訓(xùn)練，要具備相應(yīng)的安全防護(hù)措施和條件，在目前個別元素（如氧、氮等）還沒有合適的放射性同位素等等。在作示蹤實驗時，還必須注意到示蹤劑的同位素效應(yīng)和放射效應(yīng)問題。所謂同位素效應(yīng)是指放射性同位素（或是穩(wěn)定性同位素）與相應(yīng)的普通元素之間存在著化學(xué)性質(zhì)上的微小差異所引起的個別性質(zhì)上的明顯區(qū)別，對于輕元素而言，同位素效應(yīng)比較嚴(yán)重。因為同位素之間的質(zhì)量判別是倍增的，如3H質(zhì)量是1H的三倍，2H是1H的兩倍，當(dāng)用氚水（3H2O）作示蹤劑時，它在普通H2O中的含量不能過大，否則會使水的物理常數(shù)、對細(xì)胞膜的滲透及細(xì)胞質(zhì)粘性等都會發(fā)生改變。但在一般的示蹤實驗中，由同位素效應(yīng)引起的誤差，常在實驗誤差內(nèi)，可忽略不計。放射性同位素釋放的射線利于追蹤測量，但射線對生物體的作用達(dá)到一定劑量時，會改變機(jī)體的生理狀態(tài)，這就是放射性同位素的輻射效應(yīng)，因此放射性同位素的用量應(yīng)小于安全劑量，嚴(yán)格控制在生物機(jī)體所能允許的范
圍之內(nèi)，以免實驗對象受輻射損傷，而得錯誤的結(jié)果。
二、示蹤實驗的設(shè)計原則
設(shè)計一個放射性同位素的示蹤實驗應(yīng)從實驗的目的性，實驗所具備的條件和對放射性的防護(hù)水平三方面著手考慮。原則上必須從兩個主要方面來設(shè)計放射性示蹤實驗：一是必須尋求有效的、可重復(fù)的測定放射性強(qiáng)度的條件，二是必須選擇一個合適的比活度λqδ（單位是原子／時間／分子，dpm／mol或ci／mol）。其中，λ＝-dＮ’dt／Ｎ’為該處放射性原子核的衰變常數(shù)。q＝Ｎ ’／n’，表示n’個該化學(xué)形式分子為Ｎ’個放射性原子所標(biāo)記。δ＝n’／n表示放射性標(biāo)記的分子數(shù)n’與總分子數(shù)（標(biāo)記的加未標(biāo)記的）n之比。采用放射性同位素示蹤技術(shù)來實現(xiàn)所研究課題預(yù)期目的全部或一部分，一般須經(jīng)過實驗準(zhǔn)備階段，實驗階段和放射性廢物處理三個步驟。
（一）實驗準(zhǔn)備階段
1.示蹤劑的選擇
選定放射性示蹤劑的比活度λqδ的值必須足夠大，以保證實驗所需要的靈敏度，而又要盡可能地小，使得在該實驗條件下輻射自分解可忽略。一般情形是根據(jù)實驗?zāi)康暮蛯嶒炛芷陂L短，來選擇具有合適的衰變方式，輻射類型和半衰期，且放射毒性低的放射性同位素。至今已確定的放射性核素包括天然的58種和人工制造的約1300種，其中大多數(shù)不常能用作放射性示蹤劑。主要原因是制備困難、半衰期不合適及放射性不足以定量。在任何一種生產(chǎn)方法中，生產(chǎn)步驟很可能包含或多或少的化學(xué)處理，因而示蹤實驗人員需要了解某個核素及其周圍的那些元素的化學(xué)性質(zhì)，因為它們有可能成為此放射性同位素的雜質(zhì)。
放射性同位素都衰變（經(jīng)過或不經(jīng)過中間狀態(tài)）到處于基態(tài)的子體核素，衰變時伴隨各種形式的能量輻射，如α、β-、β 、γ、X放射等。在選擇示蹤劑時，示蹤實驗人員要仔細(xì)研究衰變綱圖，根據(jù)實驗條件和計數(shù)條件來決定那一種輻射，在衰變綱變內(nèi)，代表核能級的兩條水平線之間和距離表示能量差，↑或↓表示能級同伴隨原子序數(shù)增或減少的能量，↓表示從激發(fā)態(tài)至基態(tài)的同質(zhì)異能躍遷。一般要選擇最適宜的半衰期τ的放射性同位素，使τ足夠長，從而使衰變校正有意義或干脆不必作衰變校正，同時又要足夠短，能較安全地進(jìn)行示蹤實驗，并使得放射性廢物容易處理，在實際工作中，使用的放射性同位素的半衰期應(yīng)該與實驗需要持續(xù)的時間t相適應(yīng)，如對于某個實驗，t／τ＝0.04時，應(yīng)所選放射性同位素的衰變校正為3.5％；而t／τ＝0.10時，應(yīng)選放射性同位素的衰變校正為6.6％。t／τ＝0.15時，應(yīng)選用其衰變校正為10％。
在體外示蹤條件，一般選用半衰期較長而射線強(qiáng)度適中，既利于探測，又易于防護(hù)和保存的放射性示蹤劑。體內(nèi)示蹤條件下，若實驗周期短，應(yīng)選用半衰期短，且能放出一定強(qiáng)度r射線物放射性同位素，若實驗周期長，如需要將動物活殺后對組織臟器分別測定的，則應(yīng)選用半衰期較長放射性同位素。此外，根據(jù)實驗?zāi)康膩磉x用定位的或不定位的標(biāo)記示蹤劑，例如研究氨基酸的脫羧反應(yīng)，14Ｃ應(yīng)標(biāo)記在羧基上，只有這種定位標(biāo)記的氨基酸，才能在脫羧后產(chǎn)生14CO2。而有些實驗不要求特定位置標(biāo)記，只須均勻標(biāo)記即可。
選擇放射性示蹤劑還必須同時滿足高化學(xué)純度，高放射性核純度的要求。在示蹤劑制備期間、貯存期間以用試驗體系中所使用的溶劑、化學(xué)試劑、酶等可能會產(chǎn)生化學(xué)雜質(zhì)、放射化學(xué)雜質(zhì)及輻射自分解引起的放射性雜質(zhì)，這些雜質(zhì)的存在，使得示蹤實驗中使用的示蹤劑不“純”，而或多或少影響實驗的結(jié)果，甚至?xí)䦟?dǎo)致錯誤結(jié)論。 氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷（3H－TdR）和尿嘧啶核苷（3H－UR）是兩種常用的示蹤劑，前者有效地結(jié)合到DNA中，后者則摻入到RNA中，它們的輻射分解速度隨比較放射性的增高及保存時間的延長而增加，在不同溫度和不同溶液中的穩(wěn)定性也不同。經(jīng)保存八年的3H-TdR約有35％輻射分解為3H－胸腺嘧啶，并導(dǎo)致二醇和水合物的形式，在實驗中這雜質(zhì)會很快摻入細(xì)胞并與大分子（很可能是蛋白質(zhì)）結(jié)合，而不是與DNA和RNA相結(jié)合，這些雜質(zhì)用DNA酶和RNA酶處理細(xì)胞都不除去。3H－TdR和3H－UR貯存在-20℃的冷凍溶液中輻射分離速度要比 2℃增加3－4倍，但低溫度（-140℃）對貯存也有利，在允許對示蹤實驗人員在選擇保存放射性示蹤劑時會有所啟發(fā)。
2.放射性同位素測量方法的選擇
測量方法的選擇取決于射線種類，對于α射線通�？捎昧蚧\晶體、電離室、核乳膠等方法探測；對能量高的β射線可用云母窗計數(shù)管、塑料閃爍晶體及核乳膠測定，對于能量低的β射線可用液體閃爍計數(shù)器測量：對于γ射線則用G-M計數(shù)管，碘化鈉（鉈）閃爍晶體探測。目前大多數(shù)實驗室主要采用晶體閃爍計數(shù)法和液體閃爍計數(shù)法兩種測量方式。
同一臺探測儀器對不同量的示蹤劑具有不同的最佳工作條件，在實驗準(zhǔn)備階段要檢查探測器是否已調(diào)有所用示蹤同位素的工作條件，否則需要用一定量的示蹤劑作為放射源（或選用該同位素的標(biāo)準(zhǔn)源），把探測器的最佳工作條件調(diào)整好，并且要保證探測器性能處于穩(wěn)定可靠的狀態(tài)。
探測最佳工作條件的選擇方法：一種是測“坪曲線”，另一種是找最好的品質(zhì)因素。對于光電倍增管，在理論上不存在“坪”（plateau）。但隨著高壓的增加，在一定范圍內(nèi)，脈沖數(shù)變化較小，形成一段坡度較小的電壓脈沖曲線，通常也稱其為坪。測坪曲線的方法：固定放射源，根據(jù)其射線能量的大小，初選 一個廣大器增益（放大倍數(shù)）和甄別器閾值。不斷地改變高壓（由低到高，均勻增加伏度），每改變一次高壓，都測定一次本底和放射源的計數(shù)率，最后作出高壓本底計數(shù)率和高壓放射源計數(shù)曲線。用同樣的方法，作另一個甄別閾值（放大倍數(shù)不變）下的高壓計數(shù)率曲線，這樣反復(fù)多作幾條曲線。必要時，還可固定甄別閾值，改變放大倍數(shù)，求出高壓計數(shù)率曲線。應(yīng)選擇“坪”比較平坦的曲線工作條件：甄別閾值和放大增益，作為正式測定時間的儀器工作條件，高壓值應(yīng)選擇在該“坪”中點偏向起始段一邊相應(yīng)的高壓值。品質(zhì)因素，又稱為優(yōu)值，是指在一定條件下，要達(dá)到合適的統(tǒng)計數(shù)目所需要的時間是儀器的計數(shù)效率E和本底計數(shù)Nb的函數(shù)： 品質(zhì)因素F=E2／Nb它是衡量一臺計數(shù)器性能的指標(biāo)，儀器的品質(zhì)因素F應(yīng)該越大越好，品質(zhì)因素F越大，表示測量效率E越高而本底Nb越小。如果某放射性示蹤的標(biāo)準(zhǔn)源存在來源困難等問題的話，可以用相對品質(zhì)因素f來代替。 相品質(zhì)因素f=ns／nb 式中ns指某種放射性樣品的計數(shù)率。找最好品質(zhì)因素的方法與測坪曲線一樣，作出幾條高壓－F（或f）的關(guān)系曲線，在幾條曲線中選擇峰值最高的曲線。這根曲線的峰值所對應(yīng)的條件：高壓，甄別閾，放大倍數(shù)等，就是該儀器對被測同位素的最佳工作條件。最佳品質(zhì)因素不一定恰好落在“坪”上，有的在“坪”附近，有的卻在“坪”的下端。著眼于把同位素的整個能譜峰都計下來的示蹤實驗者主張取“坪”所對應(yīng)的工作條件，而著眼于優(yōu)值者，主張取最佳品質(zhì)因素所對應(yīng)的工作條件，也有人折衷。如果某儀器本底很低，光電倍增管噪音很低和能譜分辯高，二者應(yīng)該相差不大。同一臺儀器的最佳工作條件，隨儀器的使用期延長而有所改變，不同的放射性同位素，其最佳工作條件不同。因此核探測儀器的最佳工作條件具有專屬性，并且要經(jīng)常通過選擇其不同時期的最佳工作條件。更不能不問被測同位素的種類，而千篇一律地使用同一個工作條件。
為了達(dá)到準(zhǔn)確地計數(shù)，可以長時間一次計數(shù)，或短時間多次測量，兩者達(dá)到的標(biāo)準(zhǔn)誤基本相同，為避免外界因素的影響，在實際工作中，取短時間多次測量較為合理適用。在測量樣品的放射性時，本底是一個重要影響因素。本底高，則標(biāo)準(zhǔn)誤和標(biāo)準(zhǔn)誤差都增大，尤其在樣品計數(shù)較低時，本底對標(biāo)準(zhǔn)誤和標(biāo)準(zhǔn)誤差的影響就愈大，從而影響實驗結(jié)果的精度，而且為了達(dá)到一定的精度，勢別要增加樣品的測量時間。根據(jù)核衰變的統(tǒng)計規(guī)律，在實驗中如果樣品數(shù)量少，選擇tN=1.4tb的比例（式中tN為樣品放射性測量時間，tb為本底測量時間）較為合理；如果樣品數(shù)量較多是一大批樣品，則延長本底測量時間tb，取tb的時間均值，而tN則可相對短，這樣可節(jié)省時間，有利于縮短實驗周期。對于示蹤實驗設(shè)計來說，樣品中所含放射性強(qiáng)度的要求，是使其放射性計數(shù)率大于或等于本底計數(shù)的10－20倍。
3.進(jìn)行非放射性的模擬實驗，把實驗全過程預(yù)演一遍
同位素示蹤實驗要求準(zhǔn)確、仔細(xì)，稍有疏忽或考慮不周就匆忙進(jìn)行正式實驗，既容易導(dǎo)致實驗失敗，又會造成示蹤劑和其它實驗用品的浪費，還會增加放射性廢物，增加實驗室本底水平，使實驗者接受不必要的輻射劑量，所以模擬實驗不僅可以檢查正式實驗中所用器材，藥品是否合格，又可以操作人員進(jìn)行訓(xùn)練，以保證正式實驗?zāi)茼樌M(jìn)行。
（二）正式實驗階段
1.選擇放射性同位素的劑量
同位素必須能經(jīng)得起稀釋，使其最后樣品的放射性不能低于本底，一般來說放射性同位素在生物體內(nèi)不是完全均勻地被稀釋，可能在某些器官、組織、細(xì)胞、某些分子中有選擇性地蓄積，蓄積的部分放射性就會很強(qiáng)，在這種情況下，應(yīng)以相關(guān)部位對示蹤劑的蓄積率來考慮示蹤劑用量。在細(xì)胞培養(yǎng)，切片保溫，酶反應(yīng)等示蹤實驗中，應(yīng)依據(jù)實驗?zāi)康�、反�?yīng)時間及反應(yīng)體積的不同來考慮示蹤劑的用量，通常小于一個微居里或幾個微居里。 由于放射性同位素存在輻射效應(yīng)，應(yīng)該根據(jù)使用的放射性核素的種類，將用量控制在最大允許劑量之內(nèi)（maximun permissible dose），以免因劑量過大所造成的輻射效應(yīng)，給實驗帶來較大的誤差。
2.選擇示蹤劑給入途徑
整體示蹤實驗時，應(yīng)根據(jù)實驗?zāi)康�，選擇易吸收、易操作的給入途徑，一般給予的數(shù)量體積小，要求給予的劑量準(zhǔn)確，防止可能的損失和不必要的污染。體外示蹤實驗時，應(yīng)根據(jù)實驗設(shè)計的實驗步驟的某個環(huán)節(jié)加入一定劑量的示蹤到反應(yīng)系統(tǒng)中去，力求操作準(zhǔn)確，仔細(xì)。
3.放射性生物樣品的制備
根據(jù)實驗?zāi)康暮褪聚檮┑臉?biāo)記放射性同位素的性質(zhì)制備放射性生物樣品，其中放射性同位素的性質(zhì)是生物樣品制備形式的主要依據(jù)。若是釋放r射線的示蹤劑，則樣品制備比較容易，只要定量地取出被測物放入井型NaI（TL）晶體內(nèi)就能測定；若是釋放出硬β射線的示蹤劑，須將生物樣品制成厚度較薄的液體，或?qū)⒁后w鋪樣后烘干，也可灰化后鋪樣，放入塑料晶體閃爍儀內(nèi)測定，或用鐘罩型蓋一革計數(shù)管探測；若標(biāo)記同位素僅釋放軟β射線，那么樣品應(yīng)制成液體閃爍樣品（詳見放射性測量”一章），在液體閃爍計數(shù)器內(nèi)測量。不論采用何種測量方法，都應(yīng)該對樣品作定量采集。對某些放射性分散的樣品，應(yīng)當(dāng)作適當(dāng)濃集，如測定組織內(nèi)蛋白質(zhì)的放射性，應(yīng)對蛋白質(zhì)作提取處理然后制備成相應(yīng)的測量樣品。有些樣品需采用灰化法，但灰化法對易揮發(fā)的同位素或易揮發(fā)的組織樣品不合適。
4.放射性樣品的測量
測量方法分為絕對測量和相對測量。絕對測量是對樣品的實有放射性強(qiáng)度作測量，求出樣品中標(biāo)記同位素的實際衰變率，在作絕對測量時，要糾正一些因素對測量結(jié)果的影響，這些因素包括儀器探頭對于放射源的相對立體角、射線被探頭接收后被計數(shù)的幾率、反散射、 放射源的自吸收影響等等。而相對測量只是在某個固定的探測儀器上作放射性強(qiáng)度的相對測量，不追求它的實際衰變率。在一般的示蹤實驗中，大多采用相對測量的方法，比較樣品間的差異。在相對測量時，要注意保持樣品與探測器之間的幾何位置固定。幾何條件的影響是放射性測量中最重要的影響因素。當(dāng)兩個放射性強(qiáng)度相同的樣品在測量中所置的幾何位置不一，或樣品制備過程造成的幾何條件差異，其計數(shù)會相差很多，尤其當(dāng)樣品與探頭之間距離較近時，兩者計數(shù)率相差會很大。但是當(dāng)樣品與探頭之間相距較遠(yuǎn)時，由于樣品與探頭之間形成的相對立體角較小，所以兩者計數(shù)率的差異會顯著減小。在用紙片法測量3H標(biāo)記物的放射性強(qiáng)度時，要注意紙片在閃爍瓶中的位置，一批樣品應(yīng)該一致，如果是將濾紙剪成圓狀作支持物，圓片的直徑最好與閃爍瓶底的直徑相等，保證濾紙在閃爍瓶內(nèi)的位置固定。減小幾何條件對放射性測量的影響可以從三方面入手：⑴選擇探測窗大的探測器，如光電倍增管作探頭的探測器；⑵在樣品制備時，注意盡量將樣品做成點狀源，這樣當(dāng)樣品的放射性強(qiáng)度較弱時，由于距離探測窗較近而有可能造成的水平位移的影響就可以忽略；⑶無論樣品距離探測窗遠(yuǎn)近，樣品都應(yīng)置于探測窗的垂直軸線上，以減少樣品與探測窗之間的相對立體角。
（三）放射性去污染和放射性廢物處理
放射性實驗，無論是每次實驗或階段性實驗結(jié)束后，都可能有不同程度的放射性污染和放射性廢物的出現(xiàn)，因此，在實驗結(jié)束后，要作去污染處理和放射性廢物處理。必要時在實驗過程進(jìn)行中，就要作除污染和清理放射性廢物的工作。
三、同位素示蹤法在生物化學(xué)和分子生物學(xué)中的應(yīng)用
放射性同位素示蹤法在生物化學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用極為廣泛，它為揭示體內(nèi)和細(xì)胞內(nèi)理化過程的秘密，闡明生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)起了極其重要的作用。近幾年來，同位素示蹤技術(shù)在原基礎(chǔ)上又有許多新發(fā)展，如雙標(biāo)記和多標(biāo)記技術(shù)，穩(wěn)定性同位素示蹤技術(shù)，活化分析，電子顯微鏡技術(shù)，同位素技術(shù)與其它新技術(shù)相結(jié)合等。由于這些技術(shù)的發(fā)展，使生物化學(xué)從靜態(tài)進(jìn)入動態(tài)，從細(xì)胞水平進(jìn)入分子水平，闡明了一系列重大問題，如遺傳密碼、細(xì)胞膜受體、RNA-DNA逆轉(zhuǎn)錄等，使人類對生命基本現(xiàn)象的認(rèn)識開辟了一條新的途徑。下面僅就同位素示蹤技術(shù)在生物化學(xué)和分子生物學(xué)中應(yīng)用的幾個主要方面作一介紹。
1.物質(zhì)代放謝的研究
體內(nèi)存在著很多種物質(zhì)，究竟它們之間是如何轉(zhuǎn)變的，如果在研究中應(yīng)用適當(dāng)?shù)耐凰貥?biāo)記物作示蹤劑分析這些物質(zhì)中同位素含量的變化，就可以知道它們之間相互轉(zhuǎn)變的關(guān)系，還能分辯出誰是前身物，誰是產(chǎn)物 ，分析同位素示蹤劑存在于物質(zhì)分子的哪些原子上，可以進(jìn)一步推斷各種物質(zhì)之間的轉(zhuǎn)變機(jī)制。為了研究膽固醇的生物合成及其代謝，采用標(biāo)記前身物的方法，揭示了膽固醇的生成途徑和步驟，實驗證明，凡是能在體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴］o酶A的化合物，都可以作為生成膽固醇的原料，從乙酸到膽固醇的全部生物合成過程，至少包括36步化學(xué)反應(yīng)，在鯊烯與膽固醇之間，就有二十個中間物，膽固醇的生物合成途徑可簡化為:乙酸→甲基二羥戊酸→膽固醇 又如在研究肝臟膽固醇的來源時，用放射性同位素標(biāo)記物3H－膽固醇作靜脈注射的示蹤實驗說明，放射性大部分進(jìn)入肝臟，再出現(xiàn)在糞中，且甲狀腺素能加速這個過程，從而可說明肝臟是處理血漿膽固醇的主要器官，甲狀腺能降低血中膽固醇含量的機(jī)理，在于它對血漿膽固醇向肝臟轉(zhuǎn)移過程的加速作用。
2.物質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究
物質(zhì)在機(jī)體內(nèi)相互轉(zhuǎn)化的規(guī)律是生命活動中重要的本質(zhì)內(nèi)容，在過去的物質(zhì)轉(zhuǎn)化研究中，一般都采用用離體酶學(xué)方法，但是離體酶學(xué)方法的研究結(jié)果，不一定能代表整體情況，同位素示蹤技術(shù)的應(yīng)用，使有關(guān)物質(zhì)轉(zhuǎn)化的實驗的周期大大縮短，而且在離體、整體、無細(xì)胞體系的情況下都可應(yīng)用，操作簡化，測定靈敏度提高，不僅能定性，還可作定量分析。 在闡明核糖苷酸向脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)化的研究中，采用雙標(biāo)記法，對產(chǎn)物作雙標(biāo)記測量或經(jīng)化學(xué)分離后分別測量其放射性。如在鳥嘌呤核苷酸（GMP）的堿基和核糖上分別都標(biāo)記上14C，在離體系統(tǒng)中使之參入脫氧鳥嘌呤核苷酸（dGMP），然后將原標(biāo)記物和產(chǎn)物（被雙標(biāo)記GMP摻入的dGMP）分別進(jìn)行酸水解和層析分離后，測定它們各自的堿基和戊糖的放射性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們的兩部分的放射性比值基本相等，從而證明了產(chǎn)物dGMP的戊糖就原標(biāo)記物GMP的戊糖，而沒有別的來源，否則產(chǎn)物dGMP的堿基和核糖的比值一定與原標(biāo)記物GMP的兩部分比值有顯著差別。這個實驗說明戊糖脫氧是在堿基與戊糖不分記的情況下進(jìn)行的，從而證明了脫氧核糖核苷酸是由核糖核苷酸直接轉(zhuǎn)化而來的，并不是核糖核苷酸先分解成核糖與堿基，堿基再重新接上脫氧杭核糖。無細(xì)胞的示蹤實驗可以分析物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)化條件，例如以3H-dTTP為前身物作DNA摻入的示蹤實驗，按一定的實驗設(shè)計摻入后，測定產(chǎn)物DNA的放射性，作為新合成的DNA的檢出指標(biāo)。
3.動態(tài)平衡的研究
闡明生物體內(nèi)物質(zhì)處于不斷更新的動態(tài)平衡之中，是放射性同位素示蹤法對生命科學(xué)的重大貢獻(xiàn)之一，向體內(nèi)引入適當(dāng)?shù)耐凰貥?biāo)記物，在不同時間測定物質(zhì)中同位素含量的變化，就能了解該物質(zhì)在體內(nèi)的變動情況，定量計算出體內(nèi)物質(zhì)的代謝率，計算出物質(zhì)的更新速度和更新時間等等。機(jī)體內(nèi)的各種物質(zhì)都在有大小不同的代謝庫，代謝庫的大小可用同位素稀釋法求也。
4.生物樣品中微量物質(zhì)的分析
在放射性同位素示蹤技術(shù)被應(yīng)用之前，由于制備樣品時的丟失而造成回收率低以及測量靈敏度不高等問題，使得對機(jī)體正常功能起很重要作用的微量物質(zhì)不易被測定。近年來迅速發(fā)展、應(yīng)用愈來愈廣泛的放射免疫分析（radioimmunoassay）技術(shù)是一種超微量的分析方法，它可測定的物質(zhì)300多種，其中激素類居多，包括類固醇激素，多肽類激素，非肽類激素，蛋白質(zhì)物質(zhì)，環(huán)核苷酸，酶，腫瘤相關(guān)的抗原，抗體以及病原體，微量藥物等其它物質(zhì)。
5.最近鄰序列分析法（Nearest neighbour-sequence analysis method）
放射性同位素示蹤技術(shù)，是分子生物學(xué)研究中的重要手段之一，對蛋白質(zhì)生物合成的研究，從DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄到蛋白質(zhì)翻譯均起了很大的作用。最近鄰序列分析法應(yīng)用同位素示蹤技術(shù)結(jié)合酶切理論和統(tǒng)計學(xué)理論，研究證實了DNA分子中堿基排列規(guī)律，在體外作合成DNA的實驗：分四批進(jìn)行，每批用一種不同的32P標(biāo)記脫氧核苷三磷酸，32P標(biāo)記在戊糖5'C的位置上，在完全條件下合成后，用特定的酶打開5'C－P鍵，使原堿基上通過戊糖5'C相連的32P移到最鄰近的另一單核苷酸的3'C上 。用最近鄰序列分析法首次提出了DNA復(fù)制與RNA轉(zhuǎn)錄的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，從而建立了分子雜交技術(shù)，例如以噬體T2-DNA為模板制成[32P]RNA，取一定量T2-DNA和其它一些DNA加入此[32P]RNA中，經(jīng)加熱使DNA雙鏈打開，并溫育，用密度梯度離心或微孔膜分離出DNA-[32P]RNA復(fù)合體測其放射性，實驗結(jié)果只有菌體T2的DNA能與該[32P]RNA
形成放射性復(fù)合體。從而證明了RNA與DNA模板的堿基呈特殊配對的互補(bǔ)關(guān)系，用分子雜交技術(shù)還證實了從RNA到DNA的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象。此外，放射性同位素示蹤技術(shù)對分子生物學(xué)的貢獻(xiàn)還表現(xiàn)在：⑴對蛋白質(zhì)合成過程中三個連續(xù)階段，即肽鏈的起始、延伸和終止的研究；⑵核酸的分離和純化；⑶核酸末端核苷酸分析，序列測定；⑷核酸結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系；⑸RNA中的遺傳信息如何通過核苷酸的排列順序向蛋質(zhì)中氨基酸傳遞的研究等等。為了更好地應(yīng)用放射性同位素示蹤技術(shù)，除了有賴于示蹤劑的高質(zhì)量和核探測器的高靈敏度外，關(guān)鍵還在于有科學(xué)根據(jù)的設(shè)想和創(chuàng)造性的實驗設(shè)計以及各種新技術(shù)的綜合應(yīng)用。
一、同位素示蹤法基本原理和特點
同位素示蹤所利用的放射性核素（或穩(wěn)定性核素）及它們的化合物，與自然界存在的相應(yīng)普通元素及其化合物之間的化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)是相同的，只是具有不同的核物理性質(zhì)。因此，就可以用同位素作為一種標(biāo)記，制成含有同位素的標(biāo)記化合物（如標(biāo)記食物，藥物和代謝物質(zhì)等）代替相應(yīng)的非標(biāo)記化合物。利用放射性同位素不斷地放出特征射線的核物理性質(zhì)，就可以用核探測器隨時追蹤它在體內(nèi)或體外的位置、數(shù)量及其轉(zhuǎn)變等，穩(wěn)定性同位素雖然不釋放射線，但可以利用它與普通相應(yīng)同位素的質(zhì)量之差，通過質(zhì)譜儀，氣相層析儀，核磁共振等質(zhì)量分析儀器來測定。放射性同位素和穩(wěn)定性同位素都可作為示蹤劑（tracer），但是，穩(wěn)定性同位素作為示蹤劑其靈敏度較低，可獲得的種類少，價格較昂貴，其應(yīng)用范圍受到限制；而用放射性同位素作為示蹤劑不僅靈敏度，測量方法簡便易行，能準(zhǔn)確地定量，準(zhǔn)確地定位及符合所研究對象的生理條件等特點：
1.靈敏度高
放射性示蹤法可測到10-14－10-18克水平，即可以從1015個非放射性原子中檢出一個放射性原子。它比目前較敏感的重量分析天平要敏感108-107倍，而迄今最準(zhǔn)確的化學(xué)分析法很難測定到10-12克水平。
2.方法簡便
放射性測定不受其它非放射性物質(zhì)的干擾，可以省略許多復(fù)雜的物質(zhì)分離步驟，體內(nèi)示蹤時，可以利用某些放射性同位素釋放出穿透力強(qiáng)的r射線，在體外測量而獲得結(jié)果，這就大大簡化了實驗過程，做到非破壞性分析，隨著液體閃爍計數(shù)的發(fā)展，14C和3H等發(fā)射軟β射線的放射性同位素在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)實驗中得到越來越廣泛的應(yīng)用。
3.定位定量準(zhǔn)確
放射性同位素示蹤法能準(zhǔn)確定量地測定代謝物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)變,與某些形態(tài)學(xué)技術(shù)相結(jié)合（如病理組織切片技術(shù)，電子顯微鏡技術(shù)等），可以確定放射性示蹤劑在組織器官中的定量分布，并且對組織器官的定位準(zhǔn)確度可達(dá)細(xì)胞水平、亞細(xì)胞水平乃至分子水平。
4.符合生理條件
在放射性同位素實驗中，所引用的放射性標(biāo)記化合物的化學(xué)量是極微量的，它對體內(nèi)原有的相應(yīng)物質(zhì)的重量改變是微不足道的，體內(nèi)生理過程仍保持正常的平衡狀態(tài)，獲得的分析結(jié)果符合生理條件，更能反映客觀存在的事物本質(zhì)。 放射性同位素示蹤法的優(yōu)點如上所述，但也存在一些缺陷，如從事放射性同位素工作的人員要受一定的專門訓(xùn)練，要具備相應(yīng)的安全防護(hù)措施和條件，在目前個別元素（如氧、氮等）還沒有合適的放射性同位素等等。在作示蹤實驗時，還必須注意到示蹤劑的同位素效應(yīng)和放射效應(yīng)問題。所謂同位素效應(yīng)是指放射性同位素（或是穩(wěn)定性同位素）與相應(yīng)的普通元素之間存在著化學(xué)性質(zhì)上的微小差異所引起的個別性質(zhì)上的明顯區(qū)別，對于輕元素而言，同位素效應(yīng)比較嚴(yán)重。因為同位素之間的質(zhì)量判別是倍增的，如3H質(zhì)量是1H的三倍，2H是1H的兩倍，當(dāng)用氚水（3H2O）作示蹤劑時，它在普通H2O中的含量不能過大，否則會使水的物理常數(shù)、對細(xì)胞膜的滲透及細(xì)胞質(zhì)粘性等都會發(fā)生改變。但在一般的示蹤實驗中，由同位素效應(yīng)引起的誤差，常在實驗誤差內(nèi)，可忽略不計。放射性同位素釋放的射線利于追蹤測量，但射線對生物體的作用達(dá)到一定劑量時，會改變機(jī)體的生理狀態(tài)，這就是放射性同位素的輻射效應(yīng)，因此放射性同位素的用量應(yīng)小于安全劑量，嚴(yán)格控制在生物機(jī)體所能允許的范
圍之內(nèi)，以免實驗對象受輻射損傷，而得錯誤的結(jié)果。
二、示蹤實驗的設(shè)計原則
設(shè)計一個放射性同位素的示蹤實驗應(yīng)從實驗的目的性，實驗所具備的條件和對放射性的防護(hù)水平三方面著手考慮。原則上必須從兩個主要方面來設(shè)計放射性示蹤實驗：一是必須尋求有效的、可重復(fù)的測定放射性強(qiáng)度的條件，二是必須選擇一個合適的比活度λqδ（單位是原子／時間／分子，dpm／mol或ci／mol）。其中，λ＝-dＮ’dt／Ｎ’為該處放射性原子核的衰變常數(shù)。q＝Ｎ ’／n’，表示n’個該化學(xué)形式分子為Ｎ’個放射性原子所標(biāo)記。δ＝n’／n表示放射性標(biāo)記的分子數(shù)n’與總分子數(shù)（標(biāo)記的加未標(biāo)記的）n之比。采用放射性同位素示蹤技術(shù)來實現(xiàn)所研究課題預(yù)期目的全部或一部分，一般須經(jīng)過實驗準(zhǔn)備階段，實驗階段和放射性廢物處理三個步驟。
（一）實驗準(zhǔn)備階段
1.示蹤劑的選擇
選定放射性示蹤劑的比活度λqδ的值必須足夠大，以保證實驗所需要的靈敏度，而又要盡可能地小，使得在該實驗條件下輻射自分解可忽略。一般情形是根據(jù)實驗?zāi)康暮蛯嶒炛芷陂L短，來選擇具有合適的衰變方式，輻射類型和半衰期，且放射毒性低的放射性同位素。至今已確定的放射性核素包括天然的58種和人工制造的約1300種，其中大多數(shù)不常能用作放射性示蹤劑。主要原因是制備困難、半衰期不合適及放射性不足以定量。在任何一種生產(chǎn)方法中，生產(chǎn)步驟很可能包含或多或少的化學(xué)處理，因而示蹤實驗人員需要了解某個核素及其周圍的那些元素的化學(xué)性質(zhì)，因為它們有可能成為此放射性同位素的雜質(zhì)。
放射性同位素都衰變（經(jīng)過或不經(jīng)過中間狀態(tài)）到處于基態(tài)的子體核素，衰變時伴隨各種形式的能量輻射，如α、β-、β 、γ、X放射等。在選擇示蹤劑時，示蹤實驗人員要仔細(xì)研究衰變綱圖，根據(jù)實驗條件和計數(shù)條件來決定那一種輻射，在衰變綱變內(nèi)，代表核能級的兩條水平線之間和距離表示能量差，↑或↓表示能級同伴隨原子序數(shù)增或減少的能量，↓表示從激發(fā)態(tài)至基態(tài)的同質(zhì)異能躍遷。一般要選擇最適宜的半衰期τ的放射性同位素，使τ足夠長，從而使衰變校正有意義或干脆不必作衰變校正，同時又要足夠短，能較安全地進(jìn)行示蹤實驗，并使得放射性廢物容易處理，在實際工作中，使用的放射性同位素的半衰期應(yīng)該與實驗需要持續(xù)的時間t相適應(yīng)，如對于某個實驗，t／τ＝0.04時，應(yīng)所選放射性同位素的衰變校正為3.5％；而t／τ＝0.10時，應(yīng)選放射性同位素的衰變校正為6.6％。t／τ＝0.15時，應(yīng)選用其衰變校正為10％。
在體外示蹤條件，一般選用半衰期較長而射線強(qiáng)度適中，既利于探測，又易于防護(hù)和保存的放射性示蹤劑。體內(nèi)示蹤條件下，若實驗周期短，應(yīng)選用半衰期短，且能放出一定強(qiáng)度r射線物放射性同位素，若實驗周期長，如需要將動物活殺后對組織臟器分別測定的，則應(yīng)選用半衰期較長放射性同位素。此外，根據(jù)實驗?zāi)康膩磉x用定位的或不定位的標(biāo)記示蹤劑，例如研究氨基酸的脫羧反應(yīng)，14Ｃ應(yīng)標(biāo)記在羧基上，只有這種定位標(biāo)記的氨基酸，才能在脫羧后產(chǎn)生14CO2。而有些實驗不要求特定位置標(biāo)記，只須均勻標(biāo)記即可。
選擇放射性示蹤劑還必須同時滿足高化學(xué)純度，高放射性核純度的要求。在示蹤劑制備期間、貯存期間以用試驗體系中所使用的溶劑、化學(xué)試劑、酶等可能會產(chǎn)生化學(xué)雜質(zhì)、放射化學(xué)雜質(zhì)及輻射自分解引起的放射性雜質(zhì)，這些雜質(zhì)的存在，使得示蹤實驗中使用的示蹤劑不“純”，而或多或少影響實驗的結(jié)果，甚至?xí)䦟?dǎo)致錯誤結(jié)論。 氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷（3H－TdR）和尿嘧啶核苷（3H－UR）是兩種常用的示蹤劑，前者有效地結(jié)合到DNA中，后者則摻入到RNA中，它們的輻射分解速度隨比較放射性的增高及保存時間的延長而增加，在不同溫度和不同溶液中的穩(wěn)定性也不同。經(jīng)保存八年的3H-TdR約有35％輻射分解為3H－胸腺嘧啶，并導(dǎo)致二醇和水合物的形式，在實驗中這雜質(zhì)會很快摻入細(xì)胞并與大分子（很可能是蛋白質(zhì)）結(jié)合，而不是與DNA和RNA相結(jié)合，這些雜質(zhì)用DNA酶和RNA酶處理細(xì)胞都不除去。3H－TdR和3H－UR貯存在-20℃的冷凍溶液中輻射分離速度要比 2℃增加3－4倍，但低溫度（-140℃）對貯存也有利，在允許對示蹤實驗人員在選擇保存放射性示蹤劑時會有所啟發(fā)。
2.放射性同位素測量方法的選擇
測量方法的選擇取決于射線種類，對于α射線通�？捎昧蚧\晶體、電離室、核乳膠等方法探測；對能量高的β射線可用云母窗計數(shù)管、塑料閃爍晶體及核乳膠測定，對于能量低的β射線可用液體閃爍計數(shù)器測量：對于γ射線則用G-M計數(shù)管，碘化鈉（鉈）閃爍晶體探測。目前大多數(shù)實驗室主要采用晶體閃爍計數(shù)法和液體閃爍計數(shù)法兩種測量方式。
同一臺探測儀器對不同量的示蹤劑具有不同的最佳工作條件，在實驗準(zhǔn)備階段要檢查探測器是否已調(diào)有所用示蹤同位素的工作條件，否則需要用一定量的示蹤劑作為放射源（或選用該同位素的標(biāo)準(zhǔn)源），把探測器的最佳工作條件調(diào)整好，并且要保證探測器性能處于穩(wěn)定可靠的狀態(tài)。
探測最佳工作條件的選擇方法：一種是測“坪曲線”，另一種是找最好的品質(zhì)因素。對于光電倍增管，在理論上不存在“坪”（plateau）。但隨著高壓的增加，在一定范圍內(nèi)，脈沖數(shù)變化較小，形成一段坡度較小的電壓脈沖曲線，通常也稱其為坪。測坪曲線的方法：固定放射源，根據(jù)其射線能量的大小，初選 一個廣大器增益（放大倍數(shù)）和甄別器閾值。不斷地改變高壓（由低到高，均勻增加伏度），每改變一次高壓，都測定一次本底和放射源的計數(shù)率，最后作出高壓本底計數(shù)率和高壓放射源計數(shù)曲線。用同樣的方法，作另一個甄別閾值（放大倍數(shù)不變）下的高壓計數(shù)率曲線，這樣反復(fù)多作幾條曲線。必要時，還可固定甄別閾值，改變放大倍數(shù)，求出高壓計數(shù)率曲線。應(yīng)選擇“坪”比較平坦的曲線工作條件：甄別閾值和放大增益，作為正式測定時間的儀器工作條件，高壓值應(yīng)選擇在該“坪”中點偏向起始段一邊相應(yīng)的高壓值。品質(zhì)因素，又稱為優(yōu)值，是指在一定條件下，要達(dá)到合適的統(tǒng)計數(shù)目所需要的時間是儀器的計數(shù)效率E和本底計數(shù)Nb的函數(shù)： 品質(zhì)因素F=E2／Nb它是衡量一臺計數(shù)器性能的指標(biāo)，儀器的品質(zhì)因素F應(yīng)該越大越好，品質(zhì)因素F越大，表示測量效率E越高而本底Nb越小。如果某放射性示蹤的標(biāo)準(zhǔn)源存在來源困難等問題的話，可以用相對品質(zhì)因素f來代替。 相品質(zhì)因素f=ns／nb 式中ns指某種放射性樣品的計數(shù)率。找最好品質(zhì)因素的方法與測坪曲線一樣，作出幾條高壓－F（或f）的關(guān)系曲線，在幾條曲線中選擇峰值最高的曲線。這根曲線的峰值所對應(yīng)的條件：高壓，甄別閾，放大倍數(shù)等，就是該儀器對被測同位素的最佳工作條件。最佳品質(zhì)因素不一定恰好落在“坪”上，有的在“坪”附近，有的卻在“坪”的下端。著眼于把同位素的整個能譜峰都計下來的示蹤實驗者主張取“坪”所對應(yīng)的工作條件，而著眼于優(yōu)值者，主張取最佳品質(zhì)因素所對應(yīng)的工作條件，也有人折衷。如果某儀器本底很低，光電倍增管噪音很低和能譜分辯高，二者應(yīng)該相差不大。同一臺儀器的最佳工作條件，隨儀器的使用期延長而有所改變，不同的放射性同位素，其最佳工作條件不同。因此核探測儀器的最佳工作條件具有專屬性，并且要經(jīng)常通過選擇其不同時期的最佳工作條件。更不能不問被測同位素的種類，而千篇一律地使用同一個工作條件。
為了達(dá)到準(zhǔn)確地計數(shù)，可以長時間一次計數(shù)，或短時間多次測量，兩者達(dá)到的標(biāo)準(zhǔn)誤基本相同，為避免外界因素的影響，在實際工作中，取短時間多次測量較為合理適用。在測量樣品的放射性時，本底是一個重要影響因素。本底高，則標(biāo)準(zhǔn)誤和標(biāo)準(zhǔn)誤差都增大，尤其在樣品計數(shù)較低時，本底對標(biāo)準(zhǔn)誤和標(biāo)準(zhǔn)誤差的影響就愈大，從而影響實驗結(jié)果的精度，而且為了達(dá)到一定的精度，勢別要增加樣品的測量時間。根據(jù)核衰變的統(tǒng)計規(guī)律，在實驗中如果樣品數(shù)量少，選擇tN=1.4tb的比例（式中tN為樣品放射性測量時間，tb為本底測量時間）較為合理；如果樣品數(shù)量較多是一大批樣品，則延長本底測量時間tb，取tb的時間均值，而tN則可相對短，這樣可節(jié)省時間，有利于縮短實驗周期。對于示蹤實驗設(shè)計來說，樣品中所含放射性強(qiáng)度的要求，是使其放射性計數(shù)率大于或等于本底計數(shù)的10－20倍。
3.進(jìn)行非放射性的模擬實驗，把實驗全過程預(yù)演一遍
同位素示蹤實驗要求準(zhǔn)確、仔細(xì)，稍有疏忽或考慮不周就匆忙進(jìn)行正式實驗，既容易導(dǎo)致實驗失敗，又會造成示蹤劑和其它實驗用品的浪費，還會增加放射性廢物，增加實驗室本底水平，使實驗者接受不必要的輻射劑量，所以模擬實驗不僅可以檢查正式實驗中所用器材，藥品是否合格，又可以操作人員進(jìn)行訓(xùn)練，以保證正式實驗?zāi)茼樌M(jìn)行。
（二）正式實驗階段
1.選擇放射性同位素的劑量
同位素必須能經(jīng)得起稀釋，使其最后樣品的放射性不能低于本底，一般來說放射性同位素在生物體內(nèi)不是完全均勻地被稀釋，可能在某些器官、組織、細(xì)胞、某些分子中有選擇性地蓄積，蓄積的部分放射性就會很強(qiáng)，在這種情況下，應(yīng)以相關(guān)部位對示蹤劑的蓄積率來考慮示蹤劑用量。在細(xì)胞培養(yǎng)，切片保溫，酶反應(yīng)等示蹤實驗中，應(yīng)依據(jù)實驗?zāi)康�、反�?yīng)時間及反應(yīng)體積的不同來考慮示蹤劑的用量，通常小于一個微居里或幾個微居里。 由于放射性同位素存在輻射效應(yīng)，應(yīng)該根據(jù)使用的放射性核素的種類，將用量控制在最大允許劑量之內(nèi)（maximun permissible dose），以免因劑量過大所造成的輻射效應(yīng)，給實驗帶來較大的誤差。
2.選擇示蹤劑給入途徑
整體示蹤實驗時，應(yīng)根據(jù)實驗?zāi)康�，選擇易吸收、易操作的給入途徑，一般給予的數(shù)量體積小，要求給予的劑量準(zhǔn)確，防止可能的損失和不必要的污染。體外示蹤實驗時，應(yīng)根據(jù)實驗設(shè)計的實驗步驟的某個環(huán)節(jié)加入一定劑量的示蹤到反應(yīng)系統(tǒng)中去，力求操作準(zhǔn)確，仔細(xì)。
3.放射性生物樣品的制備
根據(jù)實驗?zāi)康暮褪聚檮┑臉?biāo)記放射性同位素的性質(zhì)制備放射性生物樣品，其中放射性同位素的性質(zhì)是生物樣品制備形式的主要依據(jù)。若是釋放r射線的示蹤劑，則樣品制備比較容易，只要定量地取出被測物放入井型NaI（TL）晶體內(nèi)就能測定；若是釋放出硬β射線的示蹤劑，須將生物樣品制成厚度較薄的液體，或?qū)⒁后w鋪樣后烘干，也可灰化后鋪樣，放入塑料晶體閃爍儀內(nèi)測定，或用鐘罩型蓋一革計數(shù)管探測；若標(biāo)記同位素僅釋放軟β射線，那么樣品應(yīng)制成液體閃爍樣品（詳見放射性測量”一章），在液體閃爍計數(shù)器內(nèi)測量。不論采用何種測量方法，都應(yīng)該對樣品作定量采集。對某些放射性分散的樣品，應(yīng)當(dāng)作適當(dāng)濃集，如測定組織內(nèi)蛋白質(zhì)的放射性，應(yīng)對蛋白質(zhì)作提取處理然后制備成相應(yīng)的測量樣品。有些樣品需采用灰化法，但灰化法對易揮發(fā)的同位素或易揮發(fā)的組織樣品不合適。
4.放射性樣品的測量
測量方法分為絕對測量和相對測量。絕對測量是對樣品的實有放射性強(qiáng)度作測量，求出樣品中標(biāo)記同位素的實際衰變率，在作絕對測量時，要糾正一些因素對測量結(jié)果的影響，這些因素包括儀器探頭對于放射源的相對立體角、射線被探頭接收后被計數(shù)的幾率、反散射、 放射源的自吸收影響等等。而相對測量只是在某個固定的探測儀器上作放射性強(qiáng)度的相對測量，不追求它的實際衰變率。在一般的示蹤實驗中，大多采用相對測量的方法，比較樣品間的差異。在相對測量時，要注意保持樣品與探測器之間的幾何位置固定。幾何條件的影響是放射性測量中最重要的影響因素。當(dāng)兩個放射性強(qiáng)度相同的樣品在測量中所置的幾何位置不一，或樣品制備過程造成的幾何條件差異，其計數(shù)會相差很多，尤其當(dāng)樣品與探頭之間距離較近時，兩者計數(shù)率相差會很大。但是當(dāng)樣品與探頭之間相距較遠(yuǎn)時，由于樣品與探頭之間形成的相對立體角較小，所以兩者計數(shù)率的差異會顯著減小。在用紙片法測量3H標(biāo)記物的放射性強(qiáng)度時，要注意紙片在閃爍瓶中的位置，一批樣品應(yīng)該一致，如果是將濾紙剪成圓狀作支持物，圓片的直徑最好與閃爍瓶底的直徑相等，保證濾紙在閃爍瓶內(nèi)的位置固定。減小幾何條件對放射性測量的影響可以從三方面入手：⑴選擇探測窗大的探測器，如光電倍增管作探頭的探測器；⑵在樣品制備時，注意盡量將樣品做成點狀源，這樣當(dāng)樣品的放射性強(qiáng)度較弱時，由于距離探測窗較近而有可能造成的水平位移的影響就可以忽略；⑶無論樣品距離探測窗遠(yuǎn)近，樣品都應(yīng)置于探測窗的垂直軸線上，以減少樣品與探測窗之間的相對立體角。
（三）放射性去污染和放射性廢物處理
放射性實驗，無論是每次實驗或階段性實驗結(jié)束后，都可能有不同程度的放射性污染和放射性廢物的出現(xiàn)，因此，在實驗結(jié)束后，要作去污染處理和放射性廢物處理。必要時在實驗過程進(jìn)行中，就要作除污染和清理放射性廢物的工作。
三、同位素示蹤法在生物化學(xué)和分子生物學(xué)中的應(yīng)用
放射性同位素示蹤法在生物化學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用極為廣泛，它為揭示體內(nèi)和細(xì)胞內(nèi)理化過程的秘密，闡明生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)起了極其重要的作用。近幾年來，同位素示蹤技術(shù)在原基礎(chǔ)上又有許多新發(fā)展，如雙標(biāo)記和多標(biāo)記技術(shù)，穩(wěn)定性同位素示蹤技術(shù)，活化分析，電子顯微鏡技術(shù)，同位素技術(shù)與其它新技術(shù)相結(jié)合等。由于這些技術(shù)的發(fā)展，使生物化學(xué)從靜態(tài)進(jìn)入動態(tài)，從細(xì)胞水平進(jìn)入分子水平，闡明了一系列重大問題，如遺傳密碼、細(xì)胞膜受體、RNA-DNA逆轉(zhuǎn)錄等，使人類對生命基本現(xiàn)象的認(rèn)識開辟了一條新的途徑。下面僅就同位素示蹤技術(shù)在生物化學(xué)和分子生物學(xué)中應(yīng)用的幾個主要方面作一介紹。
1.物質(zhì)代放謝的研究
體內(nèi)存在著很多種物質(zhì)，究竟它們之間是如何轉(zhuǎn)變的，如果在研究中應(yīng)用適當(dāng)?shù)耐凰貥?biāo)記物作示蹤劑分析這些物質(zhì)中同位素含量的變化，就可以知道它們之間相互轉(zhuǎn)變的關(guān)系，還能分辯出誰是前身物，誰是產(chǎn)物 ，分析同位素示蹤劑存在于物質(zhì)分子的哪些原子上，可以進(jìn)一步推斷各種物質(zhì)之間的轉(zhuǎn)變機(jī)制。為了研究膽固醇的生物合成及其代謝，采用標(biāo)記前身物的方法，揭示了膽固醇的生成途徑和步驟，實驗證明，凡是能在體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴］o酶A的化合物，都可以作為生成膽固醇的原料，從乙酸到膽固醇的全部生物合成過程，至少包括36步化學(xué)反應(yīng)，在鯊烯與膽固醇之間，就有二十個中間物，膽固醇的生物合成途徑可簡化為:乙酸→甲基二羥戊酸→膽固醇 又如在研究肝臟膽固醇的來源時，用放射性同位素標(biāo)記物3H－膽固醇作靜脈注射的示蹤實驗說明，放射性大部分進(jìn)入肝臟，再出現(xiàn)在糞中，且甲狀腺素能加速這個過程，從而可說明肝臟是處理血漿膽固醇的主要器官，甲狀腺能降低血中膽固醇含量的機(jī)理，在于它對血漿膽固醇向肝臟轉(zhuǎn)移過程的加速作用。
2.物質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究
物質(zhì)在機(jī)體內(nèi)相互轉(zhuǎn)化的規(guī)律是生命活動中重要的本質(zhì)內(nèi)容，在過去的物質(zhì)轉(zhuǎn)化研究中，一般都采用用離體酶學(xué)方法，但是離體酶學(xué)方法的研究結(jié)果，不一定能代表整體情況，同位素示蹤技術(shù)的應(yīng)用，使有關(guān)物質(zhì)轉(zhuǎn)化的實驗的周期大大縮短，而且在離體、整體、無細(xì)胞體系的情況下都可應(yīng)用，操作簡化，測定靈敏度提高，不僅能定性，還可作定量分析。 在闡明核糖苷酸向脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)化的研究中，采用雙標(biāo)記法，對產(chǎn)物作雙標(biāo)記測量或經(jīng)化學(xué)分離后分別測量其放射性。如在鳥嘌呤核苷酸（GMP）的堿基和核糖上分別都標(biāo)記上14C，在離體系統(tǒng)中使之參入脫氧鳥嘌呤核苷酸（dGMP），然后將原標(biāo)記物和產(chǎn)物（被雙標(biāo)記GMP摻入的dGMP）分別進(jìn)行酸水解和層析分離后，測定它們各自的堿基和戊糖的放射性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們的兩部分的放射性比值基本相等，從而證明了產(chǎn)物dGMP的戊糖就原標(biāo)記物GMP的戊糖，而沒有別的來源，否則產(chǎn)物dGMP的堿基和核糖的比值一定與原標(biāo)記物GMP的兩部分比值有顯著差別。這個實驗說明戊糖脫氧是在堿基與戊糖不分記的情況下進(jìn)行的，從而證明了脫氧核糖核苷酸是由核糖核苷酸直接轉(zhuǎn)化而來的，并不是核糖核苷酸先分解成核糖與堿基，堿基再重新接上脫氧杭核糖。無細(xì)胞的示蹤實驗可以分析物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)化條件，例如以3H-dTTP為前身物作DNA摻入的示蹤實驗，按一定的實驗設(shè)計摻入后，測定產(chǎn)物DNA的放射性，作為新合成的DNA的檢出指標(biāo)。
3.動態(tài)平衡的研究
闡明生物體內(nèi)物質(zhì)處于不斷更新的動態(tài)平衡之中，是放射性同位素示蹤法對生命科學(xué)的重大貢獻(xiàn)之一，向體內(nèi)引入適當(dāng)?shù)耐凰貥?biāo)記物，在不同時間測定物質(zhì)中同位素含量的變化，就能了解該物質(zhì)在體內(nèi)的變動情況，定量計算出體內(nèi)物質(zhì)的代謝率，計算出物質(zhì)的更新速度和更新時間等等。機(jī)體內(nèi)的各種物質(zhì)都在有大小不同的代謝庫，代謝庫的大小可用同位素稀釋法求也。
4.生物樣品中微量物質(zhì)的分析
在放射性同位素示蹤技術(shù)被應(yīng)用之前，由于制備樣品時的丟失而造成回收率低以及測量靈敏度不高等問題，使得對機(jī)體正常功能起很重要作用的微量物質(zhì)不易被測定。近年來迅速發(fā)展、應(yīng)用愈來愈廣泛的放射免疫分析（radioimmunoassay）技術(shù)是一種超微量的分析方法，它可測定的物質(zhì)300多種，其中激素類居多，包括類固醇激素，多肽類激素，非肽類激素，蛋白質(zhì)物質(zhì)，環(huán)核苷酸，酶，腫瘤相關(guān)的抗原，抗體以及病原體，微量藥物等其它物質(zhì)。
5.最近鄰序列分析法（Nearest neighbour-sequence analysis method）
放射性同位素示蹤技術(shù)，是分子生物學(xué)研究中的重要手段之一，對蛋白質(zhì)生物合成的研究，從DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄到蛋白質(zhì)翻譯均起了很大的作用。最近鄰序列分析法應(yīng)用同位素示蹤技術(shù)結(jié)合酶切理論和統(tǒng)計學(xué)理論，研究證實了DNA分子中堿基排列規(guī)律，在體外作合成DNA的實驗：分四批進(jìn)行，每批用一種不同的32P標(biāo)記脫氧核苷三磷酸，32P標(biāo)記在戊糖5'C的位置上，在完全條件下合成后，用特定的酶打開5'C－P鍵，使原堿基上通過戊糖5'C相連的32P移到最鄰近的另一單核苷酸的3'C上 。用最近鄰序列分析法首次提出了DNA復(fù)制與RNA轉(zhuǎn)錄的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，從而建立了分子雜交技術(shù)，例如以噬體T2-DNA為模板制成[32P]RNA，取一定量T2-DNA和其它一些DNA加入此[32P]RNA中，經(jīng)加熱使DNA雙鏈打開，并溫育，用密度梯度離心或微孔膜分離出DNA-[32P]RNA復(fù)合體測其放射性，實驗結(jié)果只有菌體T2的DNA能與該[32P]RNA
形成放射性復(fù)合體。從而證明了RNA與DNA模板的堿基呈特殊配對的互補(bǔ)關(guān)系，用分子雜交技術(shù)還證實了從RNA到DNA的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象。此外，放射性同位素示蹤技術(shù)對分子生物學(xué)的貢獻(xiàn)還表現(xiàn)在：⑴對蛋白質(zhì)合成過程中三個連續(xù)階段，即肽鏈的起始、延伸和終止的研究；⑵核酸的分離和純化；⑶核酸末端核苷酸分析，序列測定；⑷核酸結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系；⑸RNA中的遺傳信息如何通過核苷酸的排列順序向蛋質(zhì)中氨基酸傳遞的研究等等。為了更好地應(yīng)用放射性同位素示蹤技術(shù)，除了有賴于示蹤劑的高質(zhì)量和核探測器的高靈敏度外，關(guān)鍵還在于有科學(xué)根據(jù)的設(shè)想和創(chuàng)造性的實驗設(shè)計以及各種新技術(shù)的綜合應(yīng)用。
