基因組序列的迅速獲得推動(dòng)了一門(mén)新興學(xué)科——功能基因組學(xué)的發(fā)展，這一學(xué)科重點(diǎn)關(guān)注基因功能的變化。擴(kuò)增性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Amplified restriction fragment length polymorphism，AFLP）分析以及反向遺傳學(xué)都是功能基因組學(xué)的重要組成部分。
傳統(tǒng)的反向遺傳學(xué)，例如用轉(zhuǎn)座子（transposon）敲除特定基因，雖然可以準(zhǔn)確測(cè)定表型，但需要進(jìn)行耗時(shí)的轉(zhuǎn)基因或復(fù)雜的組織培養(yǎng)。而且由于這種基因敲除的方法將整個(gè)基因敲除，無(wú)法觀察到活性基因功能部分缺失的結(jié)果。
為克服此基因敲除方法的局限性，進(jìn)一步獲得關(guān)于活性基因突變的信息，F(xiàn)red Hutchinson癌癥研究中心的研究者們發(fā)明了一種定向誘導(dǎo)基因組局部突變（TILLING： Targeting Induced Local Lesions In Genomes）技術(shù)。該方法具有簡(jiǎn)單高效的特點(diǎn)，它利用化學(xué)突變方法來(lái)獲得所有基因的傳統(tǒng)的點(diǎn)突變等位基因系列。對(duì)那些表型分析時(shí)會(huì)牽涉到亞致死等位基因的重要基因，TILLING的方法具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。隨著TILLING方法有效應(yīng)用到越來(lái)越多的生物種類(lèi)，如果蠅，擬南芥，斑馬魚(yú)，玉米等，它在遺傳學(xué)研究方面的重要價(jià)值也越發(fā)體現(xiàn)出來(lái)。
但由于點(diǎn)突變一般很難被檢測(cè)出來(lái)，一直是TILLING技術(shù)應(yīng)用上的一個(gè)障礙。要得到好的結(jié)果，要求檢測(cè)儀器不僅靈敏度高，還能夠識(shí)別假陽(yáng)性位點(diǎn)。我們?cè)谶@兒給大家引薦一種更簡(jiǎn)便，靈敏，準(zhǔn)確的高通量TILLING分析技術(shù)：雙色紅外熒光檢測(cè)技術(shù)。
雙色紅外熒光檢測(cè)技術(shù)是美國(guó)LI-COR公司的專(zhuān)利技術(shù)。LI-COR長(zhǎng)期致力于此項(xiàng)技術(shù)在生物學(xué)研究中的應(yīng)用，他們開(kāi)發(fā)的Odyssey雙色熒光掃描系統(tǒng)及DNA遺傳分析系統(tǒng)都取得了很大成功。由于雜質(zhì)、干擾分子在紅外區(qū)幾乎不發(fā)光，用紅外熒光進(jìn)行檢測(cè)的背景非常低，靈敏度很高，可檢測(cè)到低達(dá)15amoles的熒光分子。加上雙通道檢測(cè)（680nm激發(fā)，710nm檢測(cè)；780nm激發(fā)，820nm檢測(cè)），兩個(gè)通道檢測(cè)波長(zhǎng)相距110nm，相對(duì)于通常的可見(jiàn)熒光四色檢測(cè)來(lái)說(shuō)，幾乎沒(méi)有光譜重疊的干擾（見(jiàn)下圖），保證了TILLING分析中每一個(gè)突變堿基的準(zhǔn)確識(shí)別及整個(gè)檢測(cè)的靈敏度。
以下就具體給大家介紹雙色紅外熒光檢測(cè)技術(shù)在反向遺傳學(xué)中與TILLING法結(jié)合的應(yīng)用，及基于雙色紅外熒光檢測(cè)技術(shù)的LI-COR 4300 DNA分析系統(tǒng)與之相應(yīng)的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。
紅外熒光檢測(cè)技術(shù)在反向遺傳學(xué)中的應(yīng)用
將紅外檢測(cè)技術(shù)同TILLING技術(shù)結(jié)合，其優(yōu)勢(shì)已經(jīng)被全世界許多實(shí)驗(yàn)室證實(shí)。美國(guó)國(guó)家科學(xué)基金會(huì)植物基因組計(jì)劃（NSF Plant Genome Research Program (PGRP)）近年來(lái)大力發(fā)展高通量TILLING，并直接推動(dòng)了以美國(guó)為首的北美實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合啟動(dòng)擬南芥 TILLING項(xiàng)目（ATP：Arabidopsis TILLING Project）。該項(xiàng)目組使用 LI-COR DNA 分析系統(tǒng)在其成立的第一年就為擬南芥研究者們提供了100多個(gè)基因上的1000多個(gè)突變位點(diǎn)。本文就以此為例來(lái)介紹紅外熒光檢測(cè)技術(shù)在反向遺傳學(xué)中的應(yīng)用。
1 對(duì)擬南芥種子進(jìn)行誘導(dǎo)處理產(chǎn)生一系列點(diǎn)突變
2 將種子培養(yǎng)，獲得第一代擬南芥突變個(gè)體
3 第一代植株自花授粉，產(chǎn)生第二代
4 將第二代植株種子收集，抽提DNA，存放于96孔板
5 將多個(gè)96孔板的樣本合并到1個(gè)96孔板內(nèi)（最多可合并8個(gè)），用兩對(duì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，兩對(duì)引物分別用700nm和800nm熒光染料標(biāo)記。
6 對(duì)擬南芥種子進(jìn)行誘導(dǎo)處理產(chǎn)生一系列點(diǎn)突變
7 將種子培養(yǎng)，獲得第一代擬南芥突變個(gè)體
8 將第二代植株種子收集，抽提DNA，存放于96孔板
9 分別得到700nm和800nm兩張圖。發(fā)生突變的泳道，在700nm的圖上可以在野生型條帶下方看到一個(gè)條帶，同時(shí)在800nm的圖上相同的泳道也會(huì)有一個(gè)條帶，這兩個(gè)條帶就是CEL I核酸酶的剪切產(chǎn)物，兩個(gè)條帶片斷大小之和等于擴(kuò)增片段的大小，從而很容易對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行突變檢測(cè)
10 當(dāng)混合樣本檢測(cè)到突變后，要對(duì)混合樣本中的每個(gè)DNA樣本再次進(jìn)行篩選，檢測(cè)出發(fā)生突變的DNA樣本。
TILLING技術(shù)路線
技術(shù)關(guān)鍵一：獲得高質(zhì)量的TILLING圖像
將紅外熒光檢測(cè)技術(shù)與TILLING技術(shù)結(jié)合后，可以同時(shí)獲得兩張真實(shí)的電泳圖像（700nm和800nm）。應(yīng)用TILLING技術(shù)時(shí)，獲得未經(jīng)修改的圖像原始數(shù)據(jù)對(duì)于檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性都很重要。如果檢測(cè)系統(tǒng)在檢測(cè)時(shí)對(duì)熒光數(shù)據(jù)已經(jīng)進(jìn)行了處理，很可能會(huì)過(guò)濾掉大部分甚至是全部的突變信息。
技術(shù)關(guān)鍵二：雙色成像能有效排除假陽(yáng)性突變
通過(guò)PCR反應(yīng)得到的異源核酸雙鏈分子在堿基錯(cuò)配處被切斷。由于兩個(gè)剪切片斷采用不同的熒光染料標(biāo)記，如果真的發(fā)生了突變，雙色檢測(cè)時(shí)將在野生型條帶下面出現(xiàn)兩個(gè)突變條帶，分別位于700nm和800nm電泳圖的同一泳道。同時(shí)，這兩個(gè)突變條帶的分子量之和應(yīng)該等于野生型條帶的分子量，因而雙色檢測(cè)能夠有效排除假陽(yáng)性點(diǎn)突變，準(zhǔn)確度很高。
技術(shù)關(guān)鍵之三：高靈敏度的紅外檢測(cè)
由于核酸外切酶活性會(huì)導(dǎo)致一些信號(hào)丟失，應(yīng)用紅外檢測(cè)技術(shù)提高靈敏度對(duì)于TILLING檢測(cè)非常重要。紅外熒光檢測(cè)相對(duì)可見(jiàn)光檢測(cè)具有背景低、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。此外，結(jié)合紅外熒光染料后，該檢測(cè)方法還具有另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)——寬廣的線性范圍。這一特點(diǎn)使得強(qiáng)信號(hào)和弱信號(hào)能夠同時(shí)被分辨，當(dāng)野生型條帶的信號(hào)強(qiáng)，突變型條帶信號(hào)弱時(shí)，LI-COR DNA分析系統(tǒng)也能夠輕松識(shí)別突變。
高通量的突變篩選
結(jié)合4300分析系統(tǒng)，TILLING作為一種高通量的篩選技術(shù)，其通量可達(dá)到：
每塊膠可檢測(cè)750，000堿基對(duì)
每天可檢測(cè)2000樣本
每天可檢測(cè)2百萬(wàn)堿基對(duì)
每個(gè)樣本可檢測(cè)1000個(gè)堿基
應(yīng)用Tilling 技術(shù)發(fā)表的一些文獻(xiàn)：
1. Till, B.J., Reynolds, S.H., Greene, E.A., Codomo, C.A., Enns, L.C., Johnson, J.E., Burtner, C., Odden, A.R., Young K., Taylor, N.E., Henikoff, J.G., Comai, L., and Henikoff, S. 2003. Large-Scale Discovery of Induced Point Mutations With High-Throughtput TILLING. Genome Research 13:524-530.
2. Henikoff, S., and Comai, L. 2003. Single-Nucleotide Mutations for Plant Functional Genomics. Annual Review of Plant Biology. 54:15.1-15.27.
3. Colbert, T., Till, B.J., Tompa, R., Reynolds, S., Steine, M.N., Yeung, A.T., McCallum, C.M., Greene, Comai, L., and Henikoff, S. 2001. High Throughtput Screening for Induced Point Mutations. Plant Physiology 126: 480-484.
4. McCallum, C.M., Comai, L., Greene, E.A., and Henikoff, S. 2000. Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) for Plant Functional Genomics. Plant Physiology 123:439–442.
紅外熒光檢測(cè)技術(shù)在AFLP研究中的應(yīng)用
除了以上提到的反向遺傳學(xué)中的應(yīng)用外，紅外熒光檢測(cè)技術(shù)在AFLP研究中的應(yīng)用也日益廣泛。該領(lǐng)域的許多文章都使用LI-COR DNA 分析系統(tǒng)完成。LI-COR公司針對(duì) AFLP研究提供包括試劑、儀器、分析軟件在內(nèi)的全套AFLP分析解決方案，不僅能進(jìn)行傳統(tǒng)的基因組AFLP分析，還提供專(zhuān)門(mén)的試劑盒進(jìn)行表達(dá)性的cDNA AFLP分析，如果結(jié)合LI-COR的Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)，還可將AFLP電泳條帶回收進(jìn)行進(jìn)一步的研究，為研究者提供了極大的便利。分析軟件方面，LI-COR公司秉承了其“功能細(xì)致強(qiáng)大，自動(dòng)化程度高”的一貫優(yōu)點(diǎn)，僅針對(duì)AFLP一項(xiàng)就有Gene ImagIRTM, SAGAMX, AFLP QuantarTM Pro三種不同的軟件，分別滿(mǎn)足一般性用戶(hù)、專(zhuān)業(yè)用戶(hù)和特殊的共顯性分析的需要，徹底解決了數(shù)據(jù)分析的瓶頸制約。
AFLP相關(guān)文獻(xiàn)：
1. Identification on Commercialized Products of AFLP Markers Able To Discriminate Slow- from Fast-Growing Chicken Strains。OLIVIER FUMIEÅ RE,*,† MARC DUBOIS,† DIMITRIE GREÄ GOIRE,† ANDREÄ THEÄ WIS,‡ ANDGILBERT BERBEN†J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 1115-1119
2. High-Throughput AFLP® Analysis Using Infrared Dye-Labeled Primers and anAutomated DNA Sequencer. A.A. Myburg, D.L. Remington, D.M. O'malley, R.R.Sederoff, and R.W. Whetton. BioTechniques 2001, 30(2): 348-357.
3. Construction of an AFLP® genetic map with nearly complete genome coverage in Pinus taeda. D.L. Remington, R.W. Whetten, B.-H. Liu, D.M. O'Malley.Theoretical Applied Genetics 1999, 98:1279-1292.
4. NA Inter-MITE polymorphisms (IMP): a high throughput transposon-based genomema pping and fingerprinting approach. R.-Y. Chang, L.S. O'Donoughue, and T.E. Bureau. Theoretical Applied Genetics 2001, 102:773-781.
