隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，檢測基因結(jié)構(gòu)和突變的方法不斷涌現(xiàn)。尤其是PCR技術(shù)問世以后，各種與PCR相結(jié)合的基因檢測技術(shù)進(jìn)一步推動了基因研究的發(fā)展。如不對稱PCR產(chǎn)物的直接測序、核糖核酸酶酶切法(Ribonuclease cleavage，RNAase)、限制性片段長度多態(tài)性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)等等已成為基因分析的有力工具.但這些方法操作比較繁瑣，局限性較大，或要求實(shí)驗(yàn)條件高，不適合一般臨床實(shí)驗(yàn)室使用.1989年問世的PCR-SSCP(下文稱SSCP)作為檢測基因突變的方法，經(jīng)不斷地改進(jìn)和完善，更為簡便、快速、靈敏，不但用于檢測基因點(diǎn)突變和短序列的缺失和插入，而且還被用于DNA定量分析，監(jiān)測PCR診斷實(shí)驗(yàn)中的交叉污染情況，以及傳染源的調(diào)查等.由于SSCP的突出的優(yōu)點(diǎn)，近幾年被大量地應(yīng)用.
一、SSCP的原理及特點(diǎn)
日本Orita等研究發(fā)現(xiàn)，單鏈DNA片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，這種立體結(jié)構(gòu)主要是由其內(nèi)部堿基配對等分子內(nèi)相互作用力來維持的，當(dāng)有一個(gè)堿基發(fā)生改變時(shí)，會或多或 少地影響其空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變，空間構(gòu)象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰 胺凝膠中受排阻大小不同.因此，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，可以非常 敏銳地將構(gòu)象上有差異的分子分離開.作者稱該方法為單鏈構(gòu)象多態(tài)性 (Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)分析.在隨后的研究中，作者又 將SSCP用于檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的基因突變，從而建立了PCR-SSCP技術(shù)，進(jìn)一步提高了檢測突變方法的簡便性和靈敏性.其基本過程是:①PCR擴(kuò)增靶DNA;②將特異的PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物變性，而后快速復(fù)性，使之成為具有一定空間結(jié)構(gòu)的單鏈DNA分子;③將適量的單 鏈DNA進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳;④最后通過放射性自顯影、銀染或溴化乙錠顯色分析結(jié)果.若發(fā)現(xiàn)單鏈DNA帶遷移率與正常對照的相比發(fā)生改變，就可以判定該鏈構(gòu) 象發(fā)生改變，進(jìn)而推斷該DNA片段中有堿基突變.該方法簡便、快速、靈敏，不需要特 殊的儀器，適合臨床實(shí)驗(yàn)的需要.但它也有不足之處.例如，只能作為一種突變檢測方 法，要最后確定突變的位置和類型，還需進(jìn)一步測序;電泳條件要求較嚴(yán)格;另外，由于SSCP是依據(jù)點(diǎn)突變引起單鏈DNA分子立體構(gòu)象的改變來實(shí)現(xiàn)電泳分離的，這樣就可能會出現(xiàn)當(dāng)某些位置的點(diǎn)突變對單鏈DNA分子立體構(gòu)象的改變不起作用或作用很小 時(shí)，再加上其他條件的影響，使聚丙烯酰胺凝膠電泳無法分辨造成漏檢.盡管如此該 方法和其他方法相比仍有較高的檢測率.首先，它可以發(fā)現(xiàn)靶DNA片段中未知位置的堿 基突變.Takao，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明小于300bp的DNA片段中的單堿基突變，90%可被SSCP發(fā) 現(xiàn)，他認(rèn)為現(xiàn)在知道的所有單堿基改變絕大多數(shù)可用該方法檢測出來.另外，SSCP方 法可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同遷移率的突變單鏈DNA分離，并且還可以進(jìn)一步 提純.用這種方法可以最終從DNA序列水平上鑒別突變DNA片段.
二、SSCP的改進(jìn)
SSCP技術(shù)自創(chuàng)立以來，經(jīng)歷了自身發(fā)展和完善的過程，剛建立時(shí)是將同位素?fù)饺隤CR 擴(kuò)增物中，通過放射自顯影來顯示結(jié)果.這給該技術(shù)的推廣造成一定的困難，隨著DNA 銀染方法與PCR-SSCP結(jié)合，尤其是直接溴乙錠染色方法的應(yīng)用，使得該方法大大簡化.最近，SSCP值得注意的改進(jìn)是將DNA-SSCP分析，改為RNA-SSCP分析,其基本原理是: RNA有著更多精細(xì)的二級和三級構(gòu)象，這些構(gòu)象對單個(gè)堿基的突變很敏感，從而提高 了檢出率，其突變檢出率可達(dá)90%以上.另外，RNA不易結(jié)合成雙鏈，因此可以較大量 的進(jìn)行電泳，有利于用溴化乙錠染色.但該方法增加了一個(gè)反轉(zhuǎn)錄過程;還需要一個(gè)較長的引物，內(nèi)含有啟動RNA聚合酶的啟動序列，從而相對地增加了該方法的難度.
為了進(jìn)一步提高SSCP的檢出率，可將SSCP分析與其它突變檢測方法相結(jié)合.其中與雜 交雙鏈分析(Heterocluplex analysis，Het)法結(jié)合可以大大提高檢出率.Het法是用 探針與要檢測的單鏈DNA或RNA進(jìn)行雜交，含有一對堿基對錯(cuò)配的雜交鏈可以和完全互 補(bǔ)的雜交鏈在非變性PAG凝膠上通過電泳被分離開.對同一靶序列分別進(jìn)行SSCP和Het 分析可以使點(diǎn)突變的檢出率接近100%，而且實(shí)驗(yàn)簡便.
三、PCR-SSCP的實(shí)驗(yàn)操作
在小于1Kb長度的情況下，DNA片段長度與丙烯酰胺的濃度選擇如下:
DNA片段長度(核苷酸數(shù)) 丙烯酰胺(%)
1Kb～700b 3.5
700b～500b 5
500b～200b 8
200b 12
在進(jìn)行SSCP前首先要通過PCR擴(kuò)增出特異性好的產(chǎn)物(瓊脂糖電泳不能有過強(qiáng)的拖尾).
1)制備聚丙烯酰胺凝膠(PAG)
按上表制所需的膠液，將梳子插入模子，從梳子一端加入膠，當(dāng)膠液快到梳齒時(shí)，使 模子向加膠端傾斜，繼續(xù)慢慢加膠，邊加邊放端模子以防止氣泡形成，室溫放置1h使 之凝固.然后拔掉梳子，頂部加入1×TBE封閉，備用.
2)電泳
取10μlPCR產(chǎn)物，加入10μl變性劑(95%甲酰胺，10mmol/LEDTA，0.02%溴酚藍(lán))、30μl 石蠟油，煮沸5min，取出立刻放入冰浴中2min以上，然后將水相全部上樣，10-15℃下 電泳.開始在300V電壓下電泳5min，然后在120V電泳8h，取下凝膠，將其浸在含 0.5ug/ml溴化錠的1×TBE緩沖液中染色30--45min，在紫外燈下觀察，或進(jìn)行銀染.
3)銀染法
將PAG板用去離子水洗二次，浸入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定6min.用去離子水洗 二次，再浸入0.2%AgNO3溶液中10min.用去離子水洗3--5次，然后浸入1.5%NaOH和 0.4%甲醛溶液中顯色7min.最后，用0.75%NaCO3終止顯色.
四、SSCP的應(yīng)用
自從Orita等用SSCP進(jìn)行人類DNA多態(tài)性分析以來，該方法大量地用于檢測和腫瘤發(fā)生 有關(guān)的基因突變，例如檢測星形細(xì)胞瘤、腦瘤、小細(xì)胞肺癌、胃癌、腸癌等腫瘤中的 p53基因的突變、肺癌的ras基因突變等.最近Sugano等用銀染色SSCP法，成功地檢測 了c-Ki-ras2基因第12位的突變，電泳和銀染色過程在2.5小時(shí)內(nèi)完成.SSCP還用于檢 測引起人類遺傳性疾病的研究上，如在囊性纖維化中起作用的CFTR基因、神經(jīng)纖維瘤 1型基因、家族性結(jié)腸息肉基因的研究中.最近，Sharkar等用RNA-SSCP法檢測了28名B 型血友病患者的凝血因子IX的基因序列，并與DNA-SSCP和直接基因測序法進(jìn)行了比 較，發(fā)現(xiàn)在全長2.6kbp的凝血因子IX基因組中，有20處堿基點(diǎn)突變，RNA-SSCP可檢測 出其中的70%，而DNA-SSCP只能檢測出35%，顯示了RNA-SSCP比DNA-SSCP有更高的靈敏 性.
SSCP法除大量地用于基因突變的檢測外，還用于病毒的分型、監(jiān)測PCR實(shí)驗(yàn)中的污染 情況、以及病原體傳播途徑的研究中.Yap用巢式PCR對來自不同國家和地區(qū)的HBV標(biāo)品 進(jìn)行了檢測，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了SSCP分析，發(fā)現(xiàn)每個(gè)標(biāo)本的SSCP圖譜完全不同，不 僅證明了HBVDNA具有地區(qū)性變異，而且排除了交叉性污染的可能性，為保證PCR診斷 結(jié)果的可靠性找到了好方法.另外，Yap等還將SSCP用于DNA定量分析上，他們將SSCP 與競爭性PCR法相結(jié)合進(jìn)行乳腺癌細(xì)胞突變p53基因的定量分析，并取得了初步成功. 該方法的優(yōu)點(diǎn)在于，內(nèi)標(biāo)和待測DNA只有一個(gè)堿基不同，這樣使內(nèi)標(biāo)和待測DNA有相同 的擴(kuò)增條件，從而更準(zhǔn)確地測出DNA的量.從以上可以看出，SSCP正在分子生物學(xué)領(lǐng)域 發(fā)揮著巨大的作用.
五、SSCP注意的事項(xiàng)
SSCP是一種快速、簡便、靈敏的檢測基因突變的方法，為了使SSCP達(dá)到最佳效果，應(yīng) 注意下列事項(xiàng).
①重復(fù)性.影響SSCP重復(fù)性的主要因素為電泳的電壓和溫度.這兩個(gè)條件保持不變， SSCP圖譜可保持良好的重復(fù)性.一般SSCP圖譜是二條單鏈DNA帶，但有時(shí)有的DNA片段 可能只呈現(xiàn)一條SSDNA帶，或者三條以上，這主要是由于兩條單鏈DNA之間存在相似的 立體構(gòu)象.有時(shí)三條以上的SSCP圖譜是由于野型DNA片段和突變型DNA片段共同存在的 結(jié)果.
②靶DNA序列長度的影響在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)SSCP對短鏈DNA或RNA的點(diǎn)突變檢出率要比長鏈 的高，這可能是由于長鏈DNA和RNA分子中單個(gè)堿基的改變在維持立體構(gòu)象中起的作用 較小的緣故.而有人認(rèn)為在DNA鏈較短的(400bp以下)情況下，DNA的長度不會影響SSCP 的效果.他們仔細(xì)選擇了實(shí)驗(yàn)條件，發(fā)現(xiàn)354bp的DNA中點(diǎn)突變的檢出率仍可達(dá)到90%以 上.
�、垭娪倦妷汉蜏囟鹊挠绊�:為了使單鏈DNA保持一定的穩(wěn)定立體構(gòu)象，SSCP應(yīng)在較低溫 度下進(jìn)行(一般4℃-15℃之間).在電泳過程中除環(huán)境溫度外，電壓過高也是引起溫度 升高的主要原因，因此，在沒有冷卻裝置的電泳槽上進(jìn)行SSCP時(shí)，開始的5min應(yīng)用較 高的電壓(250V)，以后用100V左右電壓進(jìn)行電泳.這主要是由于開始的高電壓可以使 不同立體構(gòu)象的單鏈DNA初步分離，而凝膠的溫度不會升高.隨后的低電壓電泳可以使 之進(jìn)一步分離.在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)條件確定電泳電壓.
�、蹹NA片段中點(diǎn)突變的位置對SSCP的影響點(diǎn)突變在DNA和RNA中的位置對SSCP檢測率的 影響，取決于該位置對維持立體構(gòu)象作用的大小，而不是僅僅取決于點(diǎn)突變在DNA鏈 上的位置(有人認(rèn)為點(diǎn)突變在DNA鏈中部要比在近端部容易被SSCP檢測出來).White曾 設(shè)計(jì)了一組樣品DNA片段，并將其中的點(diǎn)突變設(shè)在DNA鏈的中部，而且該點(diǎn)又正處在發(fā) 夾結(jié)構(gòu)頂端的環(huán)上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SSCP只能檢測出9個(gè)樣品中的2個(gè)(檢出率為22%)，說明 DNA鏈中任何部位的突變，只要對其單鏈立體構(gòu)象沒有影響，都有可能被漏檢.
�、軸SCP的結(jié)果斷定:由于在SSCP分析中非變性PAG電泳不是根據(jù)單鏈DNA分子和帶電量 的大小來分離的，而是以單鏈DNA片段空間構(gòu)象的立體位阻大小來實(shí)現(xiàn)分離的，因 此，這種分離不能反映出分子量的大小.有時(shí)正常鏈與突變鏈的遷移率很接近，很難 看出兩者之間的差別.因此一般要求電泳長度在16--18cm以上，以檢測限為指標(biāo)來判 定結(jié)果.檢測限是指突變DNA片段與正常DNA片段可分辨的電泳距離差的最小值.大于檢 測限則判定鏈的遷移率有改變，說明該DNA序列有變化，小于檢測限則說明鏈之間無 變化.例如，一般檢測限定為3mm，那么當(dāng)兩帶間距離在3mm以上，則說明兩鏈之間有 改變.另外檢測限不能定的太低，否則主觀因素太大，易造成假陽性結(jié)果.另外，SSCP 分析中其它條件，如PCR產(chǎn)物的上樣量，PAG的交聯(lián)度、以及膠的濃度等，都應(yīng)根據(jù)具 體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行選擇確定.總之，SSCP分析法是一種快速、簡便、靈敏的突變檢測方法， 適合臨床實(shí)驗(yàn)室的要求.它可以檢測各種點(diǎn)突變，短核苷酸序列的缺失或插入.隨著 SSCP分析不斷完善，它將成為基因診斷研究的一個(gè)有力工具.
