關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)復(fù)性；環(huán)糊精；分子伴侶
重組DNA技術(shù)為大規(guī)模生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)提供了嶄新的途徑。但人們?cè)诜蛛x純化基因工程表達(dá)產(chǎn)物時(shí)卻遇到了意想不到的困難：很多利用大腸桿菌為宿主細(xì)胞的外源基因表達(dá)產(chǎn)物如尿激酶、人胰島素、人生長激素、白介素-6、人γ-干擾素等，不僅不能分泌到細(xì)胞外，反而在細(xì)胞內(nèi)聚集成沒有生物活性的直徑約0.1～3.0μm的固體顆粒棗包含體［1］。這些基因表達(dá)產(chǎn)物的一級(jí)結(jié)構(gòu)(即氨基酸序列)雖然正確，而其立體結(jié)構(gòu)是錯(cuò)誤的，所以沒有生物活性。因此，為獲得天然狀態(tài)的目標(biāo)產(chǎn)物，必須在分離回收包含體后，溶解包含體并設(shè)法使其中的目標(biāo)蛋白質(zhì)恢復(fù)應(yīng)有的天然構(gòu)象和活性。這就向生物化學(xué)家的蛋白質(zhì)折疊機(jī)制研究提出了新課題。
1. 蛋白質(zhì)復(fù)性機(jī)制研究
分離包含體并復(fù)性蛋白質(zhì)的操作步驟并不復(fù)雜，從破碎細(xì)胞開始，然后將細(xì)胞勻漿離心，回收包含體后，加入變性劑溶解包含體，使之成為可溶性伸展態(tài)，再除去變性劑使表達(dá)產(chǎn)物折疊恢復(fù)天然構(gòu)象及活性。但在實(shí)際研究中發(fā)現(xiàn)，在體外折疊時(shí)，蛋白質(zhì)分子間由于存在大量錯(cuò)誤折疊和聚合，復(fù)性效率往往很低。究其原因，蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)雖然由其氨基酸順序決定，然而伸展肽鏈折疊為天然活性結(jié)構(gòu)的過程還受到周圍環(huán)境的影響。
為了有的放矢地開發(fā)輔助蛋白質(zhì)復(fù)性的技術(shù)，研究工作者紛紛開展了對(duì)蛋白質(zhì)折疊機(jī)制的探討。目前有兩種不同的假設(shè)：一種假設(shè)認(rèn)為，肽鏈中的局部肽段先形成一些構(gòu)象單元，如α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角等二級(jí)結(jié)構(gòu)，然后再由二級(jí)結(jié)構(gòu)單元的組合、排列，形成蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)；另一種假設(shè)認(rèn)為，首先是由肽鏈內(nèi)部的疏水相互作用導(dǎo)致一個(gè)塌陷過程，然后經(jīng)逐步調(diào)整，形成不同層次的結(jié)構(gòu)。盡管是不同的假設(shè)，但很多學(xué)者都認(rèn)為有一個(gè)所謂‘熔球態(tài)’的中間狀態(tài)。在熔球態(tài)中，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)已基本形成，其整體空間結(jié)構(gòu)也初具規(guī)模。此后，分子立體結(jié)構(gòu)再做一些局部調(diào)整，最終形成正確的立體結(jié)構(gòu)［2］�？傊�，蛋白質(zhì)折疊的具體步驟可用下式描述：
U→I→N
↓
A
即伸展態(tài)U經(jīng)過早期變化成為中間體I，然后由中間體過渡到最后的天然態(tài)N。但是從中間體折疊為天然態(tài)的同時(shí)，另有一條旁路，即中間體相互聚集為凝聚物A(包含體)。在折疊反應(yīng)中，從伸展態(tài)到中間體的形成是非�？焖俚模话阍诤撩敕秶鷥�(nèi)完成，但從中間體轉(zhuǎn)變?yōu)樘烊粦B(tài)的過程比較緩慢，是反應(yīng)的限速步驟。當(dāng)溶液中離子強(qiáng)度或變性劑濃度很低，又無其它輔助手段存在時(shí)，聚集趨勢占主導(dǎo)地位，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的自發(fā)復(fù)性效率極低。
一般認(rèn)為，蛋白質(zhì)在復(fù)性過程中，涉及兩種疏水相互作用，一是分子內(nèi)的疏水相互作用，二是部分折疊的肽鏈分子間的疏水相互作用。前者促使蛋白質(zhì)正確折疊，后者導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集而無活性，兩者互相競爭，影響蛋白質(zhì)復(fù)性收率［3］。因此，在復(fù)性過程中，抑制肽鏈間的疏水相互作用以防止聚集，是提高復(fù)性收率的關(guān)鍵。
2. 蛋白質(zhì)復(fù)性研究的初期成果
80年代后期，人們開展了廣泛的蛋白質(zhì)復(fù)性研究。例如，Carlson等發(fā)現(xiàn)，單克隆抗體具有協(xié)助蛋白質(zhì)復(fù)性的作用［4］；Cleland等發(fā)現(xiàn)，向稀釋的變性蛋白質(zhì)溶液中加入適當(dāng)濃度的聚乙二醇，可抑制蛋白質(zhì)復(fù)性過程中的凝聚沉淀，使蛋白質(zhì)復(fù)性收率提高兩倍［5］；Hagen等利用反膠團(tuán)萃取人工變性的蛋白質(zhì)后去除變性劑進(jìn)行復(fù)性，復(fù)性率可達(dá)100%［6］(但由于變性劑的存在，萃取率很低)；Batas等利用凝膠過濾色譜介質(zhì)的分子篩作用可防止變性蛋白質(zhì)間的接觸和凝聚，輔助其正確折疊［7］；Zardeneta等利用去污劑及混合膠團(tuán)，成功地輔助了脲變性硫氰酸酶復(fù)性［8］。
3. 環(huán)糊精與直鏈糊精輔助蛋白質(zhì)復(fù)性的研究
1995年，Karuppiah 和Sharma發(fā)表文章，介紹了使用環(huán)糊精輔助碳酸酐酶B的復(fù)性［9］。環(huán)糊精由淀粉通過環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶降解制得，是由D-吡喃葡萄糖單元以α-1，4-糖苷鍵相互結(jié)合成互為椅式構(gòu)象的環(huán)狀低聚糖，其分子通常含有6～12個(gè)吡喃葡萄糖單元。有實(shí)用意義的是含6、7、8個(gè)吡喃葡萄糖單元的α、β、γ-環(huán)糊精，但α-環(huán)糊精空腔較小，γ-環(huán)糊精價(jià)格昂貴，常用的是β-環(huán)糊精［10］。環(huán)糊精的特征是能形成包絡(luò)化合物，客體分子從寬口端進(jìn)入其分子空腔。包絡(luò)物的形成主要靠非共價(jià)鍵相互作用如范德華力、氫鍵、疏水相互作用、幾何形狀匹配等。利用環(huán)糊精的疏水性空腔結(jié)合變性蛋白質(zhì)多肽鏈的疏水性位點(diǎn)，可以抑制其相互聚集失活，從而促進(jìn)肽鏈正確折疊為活性蛋白質(zhì)。
1999年，Sundari等報(bào)道了用直鏈糊精輔助胰島素、碳酸酐酶和雞蛋白溶菌酶復(fù)性［11］，發(fā)現(xiàn)直鏈糊精基本上能夠模擬環(huán)糊精在輔助蛋白質(zhì)復(fù)性方面的作用，而且具有這樣一些優(yōu)點(diǎn)：直鏈糊精的螺旋結(jié)構(gòu)形成一個(gè)疏水性空管，可以結(jié)合更多的蛋白質(zhì)分子；在水中溶解度較高，有利于提高復(fù)性酶濃度和實(shí)驗(yàn)操作；價(jià)格比環(huán)糊精便宜，實(shí)際應(yīng)用前景廣闊。?
4. 分子伴侶輔助蛋白質(zhì)復(fù)性的研究
近來，越來越多的有關(guān)蛋白質(zhì)折疊的研究已轉(zhuǎn)向利用分子伴侶GroE家族。有些學(xué)者已成功地利用分子伴侶在體內(nèi)和體外輔助蛋白質(zhì)復(fù)性［12、13］。但分子伴侶在實(shí)際應(yīng)用中尚存在費(fèi)用高并需要與復(fù)性蛋白質(zhì)分離等缺點(diǎn)，因此研究開發(fā)分子伴侶的重復(fù)利用性及穩(wěn)定性是實(shí)現(xiàn)其應(yīng)用的關(guān)鍵。
GroEL具有結(jié)合蛋白質(zhì)的作用，相當(dāng)于變性蛋白質(zhì)的親和配基。固定化GroEL柱(固定床)相當(dāng)于變性蛋白質(zhì)的親和吸附層析柱，從而可提高樣品的處理量，并使蛋白質(zhì)在復(fù)性的同時(shí)得到濃縮和純化。其特點(diǎn)在于：①不僅可以解決分子伴侶的重復(fù)利用問題，而且由于固定床的利用(近于平推流)，可提高分子伴侶的利用效率；②由于采用連續(xù)操作，原料處理量大，產(chǎn)品可以得到濃縮、純化；③易于建立相關(guān)的模型，對(duì)于放大生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)作用。Teshima等利用固定化分子伴侶，在體外輔助了淀粉酶、碳酸酐酶、DNA酶的折疊復(fù)性［14］。
還有報(bào)道利用“小分子伴侶”對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行復(fù)性［15、16］。“小分子伴侶”是指GroEL的一個(gè)片段，而這個(gè)片段并不是GroEL的水解產(chǎn)物，而是由基因重組后包括GroEL191-345氨基酸殘基片段(16.7kD)或191-376氨基酸殘基片段(21kD)密碼的基因片段在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物。它們能有效地促進(jìn)親環(huán)蛋白A、硫氰酸酶以及芽孢桿菌RNA酶的復(fù)性。由于“小分子伴侶”分子較小，更適合于固定化，且不需另加復(fù)性輔助因子(如GroES和ATP等)，因此具有很大的應(yīng)用前景。
5. 人工分子伴侶在蛋白質(zhì)復(fù)性中的應(yīng)用
受蛋白質(zhì)分子伴侶輔助蛋白質(zhì)復(fù)性的啟發(fā)，Rozema和Gellman對(duì)人工分子伴侶體系(去污劑＋環(huán)糊精)輔助碳酸酐酶和雞蛋白溶菌酶復(fù)性進(jìn)行了研究［17、18］。與分子伴侶GroEL＋ATP輔助復(fù)性的作用機(jī)制相似，其復(fù)性過程分為兩步進(jìn)行：第一步捕獲階段，在變性蛋白質(zhì)溶液中加入去污劑，去污劑分子通過疏水相互作用與蛋白質(zhì)的疏水位點(diǎn)結(jié)合形成復(fù)合體，抑制肽鏈間的相互聚集；第二步剝離階段，加入環(huán)糊精，由于環(huán)糊精分子對(duì)去污劑分子有競爭性吸附作用，去污劑分子被剝離下來，從而使多肽鏈在此過程中正確折疊為活性蛋白質(zhì)［17、18］。其反應(yīng)機(jī)制可用下式表示：
U→U-dn→→→U-dn-m→→→F→N
即伸展態(tài)U首先與去污劑d形成復(fù)合物U-dn，加入環(huán)糊精后，小分子去污劑被逐次剝離下來，變?yōu)椴糠终郫B、不含去污劑分子的非活性狀態(tài)F，進(jìn)而折疊為天然活性蛋白質(zhì)N。
與GroE等蛋白質(zhì)分子伴侶相比，聯(lián)合使用去污劑和環(huán)糊精作為人工分子伴侶輔助蛋白質(zhì)復(fù)性具有明顯的優(yōu)點(diǎn)：①人工分子伴侶不屬于蛋白質(zhì)，不易受環(huán)境影響而失活，操作條件較為寬松；②去污劑和環(huán)糊精均可直接購買，省去分離純化的步驟；③去污劑與環(huán)糊精的分子量較小，容易與蛋白質(zhì)分離，有利于提高工業(yè)生產(chǎn)效率。?
參考文獻(xiàn)
［1］孫彥. 生物分離工程，北京：化學(xué)工業(yè)出版社，1998，23--24
［2］王克夷. 《生命的化學(xué)》，1999，19(5)：233--235
［3］Goldberg ME et al. Biochemistry，1991，30：2790--2797
［4］Carlson JD et al. Bio/Technol，1992，10：86--91
［5］Cleland JL. J Biol Chem，1992，267：13327--13334
［6］Hagen AJ. Biotechnol Bioeng，1990，35：955--965
［7］Batas B et al. Biotechnol Bioeng，1996，50：16--23
［8］Zardeneta G et al. J Biol Chem，1992，267(9)：5811--5816
［9］Karuppiah N et al. Biochem Biophys Res Commun，1995，211(1)：60--66
［10］靳惠等.《分析化學(xué)》，1996，24(12)：1387--1390
［11］Sundari CS et al. FEBS Letters，1999，443：215--219
［12］Smith KE et al. J Biol Chem，1995，270(37)：21517--21523
［13］Xu Z et al. J Biol Chem，1997，121：331--337
［14］Teshima T et al. Appl Microbiol Biotech，1997，48：41--46
［15］Zahn R et al. Proc Natl Acad Sci USA，1996，93：15024--15029
［16］Taguchi H et al. J Biol Chem，1994，269(11)：8529--8534
［17］Rozema D et al. J Biol Chem，1996，271：3478--3487
［18］Rozema D et al. Biochemistry，1996，35：15760--15771
(本文原刊登在《生命的化學(xué)》2000年第6期)
