怎樣優(yōu)化設計寡核苷酸呢?至少有下列幾個方面的問題需要考慮。
1. 估測可能形成的DNA或RNA雙鏈的穩(wěn)定性
寡核苷酸，無論是DNA的或者RNA的，都有形成雙鏈結構的潛在可能性，正如下面反復提到的，這種結構對寡核苷酸的作用有很大影響。所以，預測這種結構的穩(wěn)定性對設計和優(yōu)化寡核苷酸就很重要。在一個雙鏈結構中，堿基對的相對穩(wěn)定性是由其鄰近堿基決定的。在熱動力學中，這樣的性質(zhì)以雙鏈形成時的自由能(ΔG)來表示�，F(xiàn)在，大多采用 Breslauer等人提出的，以最接近的相鄰核苷酸的動力學數(shù)值(自由能)來預測雙鏈穩(wěn)定性的方法。為簡化起見，所有的計算都在25 ℃條件下進行。此時，最接近的相鄰核苷酸的自由能是：
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第一個(5′)核苷酸 |
第二個核苷酸 |
|||
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dA |
dC |
dG |
dT |
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dA |
－1.9 |
－1.3 |
－1.6 |
－1.5 |
|
dC |
－1.9 |
－3.1 |
－3.6 |
－1.6 |
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dG |
－1.6 |
－3.1 |
－3.1 |
－1.3 |
|
dT |
－1.0 |
－1.6 |
－1.9 |
－1.9 |
ΔG(kcal/mol)
例如，雙鏈d(ACGG／CCGT)的ΔG是：
ΔG(ACGG)＝ΔG(AC)＋ΔG(CG)＋ΔG(GG)＝－(1.3＋3.6＋3.1)＝－8.0 kcal/mol
此計算方法特別適用于測定其3′末端會形成雙鏈的引物的相容性。也可以用來計算發(fā)夾環(huán)結構的ΔG。不過，這時需要根據(jù)環(huán)區(qū)內(nèi)核苷酸的數(shù)量添加一定的數(shù)值。如3個核苷酸時為5.2 kcal/mol；4個時為4.5；5個為4.4；6個是4.3；7和8個為4.1 kcal／mo1。
2. 選擇引物的一般規(guī)則
設計和選擇引物時有5個要素必需注意。
2.1 引物的3′末端不互補 引物的3′末端一定不能有很大的互補性，因為它們的互補會形成引物二聚體，這就會帶來很大的問題，例如合成出非專一的產(chǎn)物，極大地減少所期望產(chǎn)物的得量。有實驗表明，3′末端雙鏈的ΔG是0～－2 kcal/mol時，PCR產(chǎn)量幾乎達到百分之百，隨著其絕對值的增加產(chǎn)量逐漸下降，在－6時只有40%，到－8時少于20%，而－10時，接近于0。雖然產(chǎn)量還取決于其他參數(shù)，如退火溫度、引物的專一性等等，但是用Taq聚合酶操作時，由于它的工作能力很強，能夠在很短的時間內(nèi)就識別3′末端互補的雙鏈區(qū)并發(fā)動聚合反應，即使3′末端雙鏈的穩(wěn)定性很差也不能阻礙它的作用，所以這時產(chǎn)量對二聚體的形成就有很大的依賴性。
2.2 引物分子內(nèi)不互補 應當盡量不用會通過釋放能量而形成分子內(nèi)雙鏈結構的寡核苷酸。雖然有些帶有發(fā)夾環(huán)，其ΔG為－3 kcal/mol的自身互補引物也可以得到不錯的結果，但是如果它的3′末端被發(fā)夾環(huán)占據(jù)時就很麻煩，即會引發(fā)引物內(nèi)部的延伸反應，減少了參與正式反應引物的數(shù)量。當然，如果發(fā)夾環(huán)在5′末端對反應就沒有多大的影響了。
2.3 引物的組分、解鏈溫度和長度 普遍認為PCR引物應當有50%的GC/AT比率。其實，這是不對的。以人基因組DNA為模板，用81% AT的引物可以產(chǎn)生單一的，專一的，長250 bp，含有70% AT的產(chǎn)物。完全沒有必要復雜地去計算產(chǎn)物和引物的解鏈溫度，PCR引物的GC/AT比率應當?shù)扔诨蚋哂谒糯蟮哪０宓腉C/AT比。
要知道，更重要的因素是模板與穩(wěn)定性較小的引物之間解鏈溫度的差異。差異越小，PCR的效率越高。因為DNA的解鏈溫度也取決于它的長度，所以有的研究者喜歡設計很長，而不求它很穩(wěn)定的引物�？墒�，引物太長就難以避免形成二聚體和自身互補，因此，一般還是不用為好。如果期待的產(chǎn)物長度等于或小于500 bp，選用短的(16～18 mer)的引物：若產(chǎn)物長5 kb，則用24 mer的引物。有人用20～23 mer引物得到40 kb的產(chǎn)物。但是，引物較長時，如果不借助引物選擇的計算機軟件幫助，就很難確定一對引物是否會形成二聚體，是否有自身互補性以及專一性如何。于是，用眼睛選出來的寡核苷酸放大長片段DNA時就會使引物彼此引發(fā)而不是延伸模板，得出非專一產(chǎn)物。通過下述的觀察內(nèi)部穩(wěn)定性原理可以極大地減少這種問題。
2.4 引物的內(nèi)部穩(wěn)定性 在DNA測序和PCR中最好用5′末端穩(wěn)定(如GC含量較多)，而3′末端不太穩(wěn)定(如AT含量較多)的引物，這種引物的結構可以有效地消除假引發(fā)反應。這就是基于引物內(nèi)部穩(wěn)定性的經(jīng)驗之談。其3′末端穩(wěn)定性低的引物在這些反應中能起好作用的原因在于，接近或在3′末端上的堿基與非靶位點堿基所形成的配對的穩(wěn)定程度還不足以引發(fā)DNA合成，所以不會產(chǎn)生假產(chǎn)物。因此，為了有效地引發(fā)反應，引物的5′末端和中央部分必須與靶DNA也形成雙鏈。與此相反，帶有穩(wěn)定的、GC豐富的3′末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都與靶序列配對，只憑借其3′末端與靶序列任何位點的牢固配合就可以引發(fā)反應，產(chǎn)生非專一產(chǎn)物。
如果用3′末端低穩(wěn)定性的引物，反應的最適退火溫度范圍會不尋常的寬。這就可以不經(jīng)過事先的最佳化實驗就能在最佳條件下進行反應。還要注意的是PCR反應產(chǎn)物的質(zhì)量還取決于模板(底物的復雜性、Tm、產(chǎn)物長度)和退火的溫度與時間。
所以，有時3′末端穩(wěn)定的引物也可以滿意地進行反應。但是，無論如何，寡核苷酸3′末端最后5個核苷酸的穩(wěn)定性小于－9 kcal/mol的，通常就是專一性的探針或引物。寡核苷酸3′末端越不穩(wěn)定，假引發(fā)的可能性越低。
2.5 引物的唯一性 為了放大單個的、專一性DNA片段，選用的引物序列就應當是唯一的，即在模板中沒有重復序列。雖然不會整個引物序列都偏好于和模板中的一個以上位點匹配，但是，通常見到的引物的3′末端往往都有6～7個沒有什么個性的核苷酸。如果假引發(fā)的位點正好在放大區(qū)的內(nèi)部，那麻煩就大了。由于短的DNA片段有更高的PCR或雜交效率，就容易產(chǎn)生非專一產(chǎn)物。
如果用哺乳動物基因組序列作為模板，可以用Alu序列或其他短重復元件來核對想用的引物的互補性。由此也可知，應當避免使用同寡聚物(如—AAAAAA—)和二核苷酸重復(如—ATATAT—)。
3. 按照氨基酸序列設計寡核苷酸
按照多肽的氨基酸序列來設計 PCR引物或雜交探針是最常用的實驗手段，尤其是在試圖“釣取”一個蛋白質(zhì)的基因時。此時要注意的問題有：
(1)寧可用簡并引物，也不用猜測的引物。氨基酸密碼子的簡并性給予引物設計以可塑性，這比用猜測的密碼子要好得多。有人用1 024個簡并引物得到很好的結果。
但是，應當避免在一個區(qū)域內(nèi)有很高的簡并性。但也有簡并性低使引物不工作的報道。
(2)引物與模板的錯配。一般認為，所用引物與模板有15%～20%的錯配，PCR的效果還能接受。但是，引物3′末端的錯配比同樣錯配率的5′末端錯配會引起更嚴重的問題。
在最后4個堿基中有2個錯配的引物，其 PCR產(chǎn)量急劇下降。但是，當核苷酸濃度高時，3′末端有錯配的引物還能被Tag聚合酶很好地利用。在0.8 mmol/L時，大多數(shù)3′末端錯配引物可以接受，雖然非專一產(chǎn)物比較多，DNA合成的忠實性也下降。即使在低核苷濃度下，還會有少量從錯配堿基出發(fā)的合成，因此，在開始的PCR循環(huán)中把退火時間增加到3～5分鐘，比之于用標準退火時間和高濃度核苷酸能夠產(chǎn)生質(zhì)量更好的所求產(chǎn)物。
(3)在用唯一性引物時，建議用0.2 mmol/L或更低的總核苷酸濃度，因為高濃度會增加錯誤參入的比率。
(4)簡并寡核苷酸時，PCR應當在比較高的引物濃度下進行，即1～3 μmol/L而不是0.2 μmol/L，因為在反應混合物中的大多數(shù)寡聚物并不是被用來引發(fā)專一的反應，而只是產(chǎn)生高的背景而已。
