生命科學(xué)被譽(yù)為21世紀(jì)的最前沿科學(xué)之一，隨著人類第一張基因序列草圖的完成和發(fā)展，生命科學(xué)的研究也將進(jìn)入一個(gè)嶄新的后基因組學(xué)，即蛋白質(zhì)組學(xué)時(shí)代。正如基因草圖的提前繪制得益于大規(guī)模全自動(dòng)毛細(xì)管測序技術(shù)一樣，后基因組研究也將會(huì)借助于現(xiàn)代生物質(zhì)譜技術(shù)等得到迅猛發(fā)展。本文擬簡述生物質(zhì)譜技術(shù)及其在生命科學(xué)領(lǐng)域研究中的應(yīng)用。
1 質(zhì)譜技術(shù)
質(zhì)譜（ Mass SPectrometry）是帶電原子、分子或分子碎片按質(zhì)荷比（或質(zhì)量）的大小順序排列的圖譜。質(zhì)譜儀是一類能使物質(zhì)粒子高化成離子并通過適當(dāng)?shù)碾妶�、磁場將它們按空間位置、時(shí)間先后或者軌道穩(wěn)定與否實(shí)現(xiàn)質(zhì)荷比分離，并檢測強(qiáng)度后進(jìn)行物質(zhì)分析的儀器。質(zhì)譜儀主要由分析系統(tǒng)、電學(xué)系統(tǒng)和真空系統(tǒng)組成。
質(zhì)譜分析的基本原理
用于分析的樣品分子（或原子）在離子源中離化成具有不同質(zhì)量的單電行分子離子和碎片離子，這些單電荷離子在加速電場中獲得相同的動(dòng)能并形成一束離子，進(jìn)入由電場和磁場組成的分析器，離子束中速度較慢的離子通過電場后編轉(zhuǎn)大，速度快的偏轉(zhuǎn)�。辉诖艌鲋须x子發(fā)生角速度矢量相反的偏轉(zhuǎn)，即速度慢的離子依然偏轉(zhuǎn)大，速度快的偏轉(zhuǎn)�。划�(dāng)兩個(gè)場的偏轉(zhuǎn)作用彼此補(bǔ)償時(shí)，它們的軌道便相交于一點(diǎn)。與此同時(shí)，在磁場中還能發(fā)生質(zhì)量的分離，這樣就使具有同一質(zhì)荷比而速度不同的離子聚焦在同一點(diǎn)上，不同質(zhì)荷比的離子聚焦在不同的點(diǎn)上，其焦面接近于平面，在此處用檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測即可得到不同質(zhì)荷比的譜線，即質(zhì)譜。通過質(zhì)譜分析，我們可以獲得分析樣品的分子量、分子式、分子中同位素構(gòu)成和分子結(jié)構(gòu)等多方面的信息。
質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展
質(zhì)譜的開發(fā)歷史要追溯到20世紀(jì)初J.J.Thomson創(chuàng)制的拋物線質(zhì)譜裝置，1919年Aston制成了第一臺(tái)速度聚焦型質(zhì)譜儀，成為了質(zhì)譜發(fā)展史上的里程碑。
最初的質(zhì)譜儀主要用來測定元素或同位素的原子量，隨著離子光學(xué)理論的發(fā)展，質(zhì)譜儀不斷改進(jìn)，其應(yīng)用范圍也在不斷擴(kuò)大，到20世紀(jì)50年代后期已廣泛地應(yīng)用于無機(jī)化合物和有機(jī)化合物的測定。
現(xiàn)今，質(zhì)譜分析的足跡已遍布各個(gè)學(xué)科的技術(shù)領(lǐng)域，在固體物理、冶金、電子、航天、原子能、地球和宇宙化學(xué)、生物化學(xué)及生命科學(xué)等領(lǐng)域均有著廣闊的應(yīng)用。質(zhì)譜技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，更為質(zhì)譜的發(fā)展注入了新的活力，形成了獨(dú)特的生物質(zhì)譜技術(shù)。
2 生物質(zhì)譜技術(shù)
電噴霧質(zhì)譜技術(shù)和基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜技術(shù)是誕生于80年代末期的兩項(xiàng)軌電離技術(shù)。這兩項(xiàng)技術(shù)的出現(xiàn)使傳統(tǒng)的主要用于小分子物質(zhì)研究的質(zhì)譜技術(shù)發(fā)生了革命性的變革。它們具有高靈敏度和高質(zhì)量檢測范圍，使得在pmol（10-12甚至fmol（10-15的水平上準(zhǔn)確地分析分子量高達(dá)幾萬到幾十萬的生物大分子成為可能，從而使質(zhì)譜技術(shù)真正走入了生命科學(xué)的研究領(lǐng)域，并得到迅速的發(fā)展。以下主要介紹與生物醫(yī)學(xué)有關(guān)的幾項(xiàng)質(zhì)譜技術(shù)。
電噴霧質(zhì)譜技術(shù)
電噴霧質(zhì)譜技術(shù)（Electrospray Ionizsation MassSpectrometry,ESI-MS）是在毛細(xì)管的出口處施加一高電壓，所產(chǎn)生的高電場使從毛細(xì)管流出的液體霧化成細(xì)小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發(fā)，液滴表面的電荷強(qiáng)度逐漸增大，最后液滴崩解為大量帶一個(gè)或多個(gè)電荷的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進(jìn)入氣相。電噴霧離子化的特點(diǎn)是產(chǎn)生高電荷離子而不是碎片離子，使質(zhì)量電荷比（m/z）降低到多數(shù)質(zhì)量分析儀器都可以檢測的范圍，因而大大擴(kuò)展了分子量的分析范圍，離子的真實(shí)分子質(zhì)量也可以根據(jù)質(zhì)荷比及電行數(shù)算出。
電噴霧質(zhì)譜的優(yōu)勢就是它可以方便地與多種分離技術(shù)聯(lián)合使用，如液一質(zhì)聯(lián)用（LC－MS）是將液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)合而達(dá)到檢測大分子物質(zhì)的目的。
基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜技術(shù)
基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜技術(shù)（MatriX AssistedLaser Desorption /Ionization,MALDI）的基本原理是將分析物分散在基質(zhì)分子中并形成晶體，當(dāng)用激光照射晶體時(shí)，由于基質(zhì)分子經(jīng)輻射所吸收的能量，導(dǎo)致能量蓄積并迅速產(chǎn)熱，從而使基質(zhì)晶體升華，致使基質(zhì)和分析物膨脹并進(jìn)入氣相。MALDAI所產(chǎn)生的質(zhì)譜圖多為單電荷離子，因而質(zhì)譜圖中的離子與多肽和蛋白質(zhì)的質(zhì)量有—一對應(yīng)關(guān)系。
MALDI產(chǎn)生的離子常用飛行時(shí)間（Time-of-Flight,TOF）檢測器來檢測，理論上講，只要飛行管的長度足夠，TOF檢測器可檢測分子的質(zhì)量數(shù)是沒有上限的，因此MALDI-TOF質(zhì)譜很適合對蛋白質(zhì)、多肽、核酸和多糖等生物大分子的研究。
快原子轟擊質(zhì)譜技術(shù)
快原子轟擊質(zhì)譜技術(shù)（Fast Atom Bomebard-ment Mass Spectrometry ,FABMS）是一種軟電離技術(shù)，是用快速惰性原子射擊存在于底物中的樣品，使樣品離子濺出進(jìn)入分析器，這種軟電離技術(shù)適于極性強(qiáng)、熱不穩(wěn)定的化合物的分析，特加適用于多肽和蛋白質(zhì)等的分析研究。
FABMS只能提供有關(guān)離子的精確質(zhì)量，從而可以確定樣品的元素組成和分子式。而FABMS－MS串聯(lián)技術(shù)的應(yīng)用可以提供樣品較為詳細(xì)的分子結(jié)構(gòu)信息，從而使其在生物醫(yī)學(xué)分析中迅速發(fā)展起來。
同位素質(zhì)譜
同位素質(zhì)譜是一種開發(fā)和應(yīng)用比較早的技術(shù)，被廣泛地應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，但它在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用只是近幾年的事。由于某些病原菌具有分解特定化合物的能力，該化合物又易于用同位素標(biāo)示，人們就想到用同位素質(zhì)譜的方法檢測其代謝物中同位素的含量以達(dá)到檢測該病原菌的目的，同時(shí)也為同位素質(zhì)譜在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用開辟了一條思路。
3 生物質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用
隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷改進(jìn)和完善，質(zhì)譜的應(yīng)用范圍已擴(kuò)展到生命科學(xué)研究的許多領(lǐng)域，特別是質(zhì)譜在蛋白質(zhì)、醫(yī)學(xué)檢測、藥物成分分析及核酸等領(lǐng)域的應(yīng)用，不僅為生命科學(xué)研究提供了新方法，同時(shí)也促進(jìn)了質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展。
質(zhì)譜與蛋白質(zhì)分析
蛋白質(zhì)分子量的測定 蛋白質(zhì)類生物大分子分子量的測定有著十分重要的意義，如對均一蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定，既要測定蛋白質(zhì)的分子量，又要測定亞基和寡聚體的分子量及水解、酶解碎片的分子量。常規(guī)的分子量測定主要有滲透壓法、光散射法、超速高心法、凝膠層析及聚丙烯酸胺凝膠電泳等。這些方法存在樣品消耗量大，精確度低易受蛋白質(zhì)的形狀影響等缺點(diǎn)。
MALI－MS技術(shù)以其極高的靈敏度、精確度很快在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，特別是在蛋白質(zhì)分析中的應(yīng)用，至今已被分析的蛋白質(zhì)已有數(shù)百種之多，不僅可測定各種親水性、疏水性及糖蛋白等的分子量，還可直接用來測定蛋白質(zhì)混合物的分子量，也能被用來測定經(jīng)酶等降解后的混合物，以確定多肽的氨基酸序列�？梢哉J(rèn)為這是蛋白質(zhì)分析領(lǐng)域的一項(xiàng)重大突破。
蛋白質(zhì)組研究 蛋白質(zhì)組是指一個(gè)基因組、一個(gè)細(xì)胞或組織所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)成分。蛋白質(zhì)組的研究是從整體水平上研究細(xì)胞或有機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)的組成及其活動(dòng)規(guī)律，包括細(xì)胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)的分離、蛋白質(zhì)表達(dá)模式的識別、蛋白質(zhì)的鑒定、蛋白質(zhì)翻譯后修飾的分析及蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建。質(zhì)譜技術(shù)作為蛋白質(zhì)組研究的三大支撐技術(shù)之一，除了用于多肽、蛋白質(zhì)的質(zhì)量測定外，還廣泛地應(yīng)用于肽指紋圖譜測定以及氨基酸序列惻定等。
肽指紋圖譜（ PePtide Mass Fingerprinting,PMF）測定是對蛋白酶解或降解后所得多肽混合物進(jìn)行質(zhì)譜分析的方法，對質(zhì)譜分析所得肽片與多肽蛋白數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)的理論肽片進(jìn)行比較，從而判別所測蛋白是已知還是未知。由于不同的蛋白質(zhì)具有不同的氨基酸序列，因而不同蛋白質(zhì)所得肽片具有指紋的特征。
采用肽指紋譜的方法已對酵母、大腸桿菌、人心肌等多種蛋白質(zhì)組進(jìn)行了研究。對大腸桿菌經(jīng)PVDF膜轉(zhuǎn)印的蛋白質(zhì)的研究表明，三個(gè)肽片即可達(dá)到對蛋白質(zhì)的正確識別。而采用原位酶解的方法對酵母蛋白質(zhì)組研究的結(jié)果顯示，約90％的蛋白質(zhì)被識別，其中三十多種新蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)，而這些蛋白質(zhì)是酵母基因組研究中未能識別的開放閱讀框架。研究顯示，肽指紋譜的方法比氨基酸組成分析更為可靠，這是因?yàn)镸ALDI測定肽質(zhì)量的準(zhǔn)確度為99．9％，而氨基酸組成分析的準(zhǔn)確度僅為90％。另外MALDI可以耐受少量雜質(zhì)的存在，對于純度不是很高的樣品也能得到理想的結(jié)果。
對肽序列的測定往往要通過串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)才能達(dá)到分析目的，它采用不同的質(zhì)譜技術(shù)選擇具有特定質(zhì)荷比的離子，并對其進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解高，通過推斷肽片的斷裂，即可導(dǎo)出肽序列。
質(zhì)譜與核酸研究
現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)自誕生以來在多肽及蛋白質(zhì)的研究中獲得了極大的成功，于是人們開始償試著特質(zhì)譜技術(shù)用于核酸的研究工作，近年來合成寡核苷酸及其類似物作為反義治療劑在病毒感染和一些癌癥的治療方面有著良好的前景，寡核苷酸作為藥物其結(jié)構(gòu)特征必須進(jìn)行確證。常規(guī)的色譜或電泳技術(shù)只能對其濃度和純度進(jìn)行分析，而對其堿基組成、序列等結(jié)構(gòu)信息卻無能為力。
ESI和MALDI質(zhì)譜技術(shù)的出現(xiàn)為寡核苷酸及其類似物的結(jié)構(gòu)和序列分析提供了強(qiáng)有力的方法，它是將被測寡核苷酸樣品先用外切酶從3’或5’端進(jìn)行部分降解，在不同時(shí)間內(nèi)分別取樣進(jìn)行質(zhì)譜分析，獲得寡核苷酸部分降解的分子離子峰信號，通過對相鄰兩個(gè)碎片分子質(zhì)量進(jìn)行比較，可以計(jì)算出被切割的核苷酸單體分子質(zhì)量，將其與四個(gè)脫氧苷酸的標(biāo)準(zhǔn)分子量進(jìn)行對照，就可以讀出寡核苷酸的序列。由于MALDI技術(shù)分辨率的問題，使得其更適合于減基數(shù)較少的短鏈核酸的分析。
如何獲得高分辨率的DNA質(zhì)譜圖一時(shí)間成為了研究的熱點(diǎn)問題，由于DNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)存在著不同于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征，使得DNA樣品存在某些特殊性，一是其結(jié)構(gòu)中存在著磷酸基團(tuán)，有形成鈉磷化合離子的趨勢；二是在激光解吸離子化過程中它的結(jié)構(gòu)不如蛋白質(zhì)穩(wěn)定，易形成碎片，這導(dǎo)致峰寬和分子離子的強(qiáng)度變?nèi)�，從而使得分辨率下降�?/p>
1995年，M．L．Vestal等把離子延遲引出（lonDelayed Extraction, DE）技術(shù)應(yīng)用于MALDI－MS中，不但提高了MALDI－MS的分辨率，而且也開創(chuàng)了質(zhì)譜應(yīng)用于DNA研究領(lǐng)域的新局面。國內(nèi)鄧慧敏等也應(yīng)用DE－MALDI-MS法測定了混合堿基DNA，獲得了高分辨率的DNA質(zhì)譜圖。
質(zhì)譜與臨床醫(yī)學(xué)
除了應(yīng)用于蛋白質(zhì)和核酸研究以外，質(zhì)譜還以其靈敏度和高分辨率在臨床醫(yī)學(xué)檢直中得到了廣泛的應(yīng)用，如對藥物代謝產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)分析，癌細(xì)胞蛋白質(zhì)的鑒定，同位素標(biāo)記物的檢測等。其中用同位素14C標(biāo)記的14C-尿素呼吸試驗(yàn)和15N標(biāo)記的15N-排泄試驗(yàn)已成為臨床檢測胃幽門螺桿菌（HP）的有效手段。
質(zhì)譜與檢測
隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，大量的生物工程產(chǎn)品不斷出現(xiàn)，傳統(tǒng)的測定分子量及純度的方法已不能擔(dān)當(dāng)此重任，現(xiàn)在人們把MALDI-TOF-MS應(yīng)用于此領(lǐng)域，得到了很好的效果。蔡耘等用上述技術(shù)對重組的人表皮生長因子（hEGF）白細(xì)胞介素-3（IL－3）、腫瘤壞死因子（TNF）粒細(xì)胞＼巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM－CSF）、粒細(xì)胞集落刺激因子（G—CSF）堿性成纖維生長因子（bFGF）等六種基因工程產(chǎn)品進(jìn)行了測定，獲得了準(zhǔn)確的分子量信息及純度信息，這為基因工程產(chǎn)品的檢測研究開辟了一條新途徑。
4 展望
隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，質(zhì)譜也得到了快速的發(fā)展，特別是與生物技術(shù)的結(jié)合，開創(chuàng)了質(zhì)譜應(yīng)用的新領(lǐng)域，質(zhì)譜已成為生命科學(xué)研究中非常重要的工具。其研究成果也將大大非富人類基因組的研究，并將使人類對生命的本質(zhì)，其發(fā)生發(fā)展過程的認(rèn)識達(dá)到一個(gè)前所未有的新高度。
