1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />提取人體細(xì)胞的總RNA和mRNA。
2、本實(shí)驗(yàn)所需試劑
1）、CNE-2細(xì)胞及培養(yǎng)細(xì)胞的一系列條件，
2）、PBS緩沖液， TRIZOL試劑，
3）、DEPC處理過(guò)的水、大、中、小Tip及1.5 ml EP管,
4）、新的氯仿、異丙醇和乙醇，
5）、mRNA分離試劑盒：Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN。
6）、新配的電泳緩沖液，專跑RNA的瓊脂糖（Agarose）。
3、實(shí)驗(yàn)流程
3.1 細(xì)胞總RNA的提取
1）、6孔板細(xì)胞（CNE-2）匯合度為90-100%時(shí)，取出無(wú)菌室，去其上清，用PBS洗兩次后，每孔加TRIZOL試劑（Gibco公司） 1 ml，搖勻，無(wú)菌罩內(nèi)消化3-5分鐘（觀察：液體變粘稠，細(xì)胞脫壁）。
2）、將各孔內(nèi)消化好的細(xì)胞裂解液吸到一DEPC處理過(guò)的1.5 ml EP管中，加新開(kāi)的氯仿0.2 ml，輕搖15秒。
3）、室溫靜置2-3分鐘后，12000 rpm，15 min，4℃，離心。然后取上清無(wú)色水相（約0.6 ml）到 EP管（DEPC處理過(guò)），加0.5 ml新開(kāi)的異丙醇，室溫下靜置10分鐘。
4）、12000 rpm，10分鐘，4℃，離心。觀察總RNA在管底的白色沉淀，棄去上清（小心別丟了沉淀），75%乙醇1.0 ml洗滌（用DEPC水新配制）后，7500 rpm，5 min，4℃離心。
5）、去上清，點(diǎn)離，用小Tip吸干液體。氣干沉淀5-10分鐘， DEPC處理水20-30 ul加入，中槍打勻，55-60℃水浴10分鐘溶解總RNA，測(cè)OD值。
6）、電泳。
3.2 從總RNA中分離mRNA（Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN）
1）、取上述提取的總RNA若干（少于0.25 mg）到一個(gè)新的無(wú)RNase 的EP管中，用無(wú)RNase的水定容到250 ul。
2）、加入Buffer OBB 250 ul, Oligotex Suspension 15 ul。用Tip打勻或用手彈勻。
3）、70℃水浴，3分鐘（裂解RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)）。
4）、20-30℃條件下，靜置10分鐘（讓Oligotex與mRNA結(jié)合）。
5）、高速離心2分鐘，小心吸走上清（該上清要保留），留下約50 ul的上清在原管里。
6）、用Buffer OW2 400 ul重懸含Oligotex/mRNA復(fù)合物的沉淀，然后將這些加到套有1.5 ml EP管的SPIN柱子上，高速離心1分鐘。
7）、將SPIN柱子移到一個(gè)新的EP管上，加Buffer OW2 400 ul到柱子，高速離心1分鐘，丟掉濾過(guò)液。
8）、將SPIN柱子移到一個(gè)新的EP管上，加20-100 ul熱的（70℃）Buffer OEB到柱子上，用Tip來(lái)回吸打3-4次，高速離心1分鐘。
9）、為保證最大的 mRNA產(chǎn)量，可再次重復(fù)第8步。
10）、電泳。
4、mRNA的應(yīng)用：
RT-PCR, Northern雜交，cDNA文庫(kù)構(gòu)建, mRNA末端快速擴(kuò)增(RACE)，差異表達(dá)(DDRT-PCR)，引物延伸反應(yīng)(Primer Extension)，體外轉(zhuǎn)錄(In Vitro RNA Transcription), RNA標(biāo)記(RNA labeling)，RNA酶保護(hù)試驗(yàn)(RNase and S1 Nuclease Protection Assay)，RNA微注射(RNA Microinjection)
