質(zhì)譜方法(Mass Spectroscope,MS)是通過(guò)正確測(cè)定蛋白質(zhì)分子的質(zhì)量而進(jìn)行蛋白質(zhì)分子鑒定、蛋白質(zhì)分子的修飾和蛋白質(zhì)分子相互作用的研究。質(zhì)譜儀通過(guò)測(cè)定離子化生物分子的質(zhì)荷比便可得到相關(guān)分子的質(zhì)量。但長(zhǎng)期以來(lái)，質(zhì)譜方法僅限于小分子和中等分子的研究，因?yàn)橐獙①|(zhì)譜應(yīng)用于生物大分子需要將之制備成氣相帶電分子，然后在真空中物理分解成離子。但如何使蛋白分子經(jīng)受住離子化過(guò)程轉(zhuǎn)成氣相帶電的離子而又不喪失其結(jié)構(gòu)形狀是個(gè)難題。20世紀(jì)70年代，解吸技術(shù)的出現(xiàn)成功地將蛋白分子轉(zhuǎn)化成氣相離子。爾后快原子轟擊與其緊密相關(guān)的溶液基質(zhì)二次離子質(zhì)譜法使得具有極性的、熱不穩(wěn)定的蛋白分子可經(jīng)受住電離過(guò)程。但這些方法僅限于10kD以下蛋白分子的研究。80年代電噴霧電離(ESI)和軟激光解吸(SLD)電離技術(shù)的發(fā)展則使得質(zhì)譜方法應(yīng)用于高分子量蛋白分子的研究。
電噴霧電離(ESI)原理可按電荷殘留模型予以描述，帶電液滴蒸發(fā)，液滴變小，液滴表面相斥的靜電荷密度增大。當(dāng)液滴蒸發(fā)到某一程度，液滴表面的庫(kù)侖斥力使液滴爆炸。產(chǎn)生的小帶電液滴繼續(xù)此過(guò)程。隨著液滴的水分子逐漸蒸發(fā)，就可獲得自由徘徊的質(zhì)子化和去質(zhì)子化的蛋白分子。針對(duì)電噴霧電離所產(chǎn)生的多電荷狀態(tài)，F(xiàn)enn將多電荷狀態(tài)理解為對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行多次獨(dú)立的測(cè)量，并基于聯(lián)立方程解的平均方法，獲得對(duì)分子質(zhì)量的正確估量，解決了多電荷離子信息的問(wèn)題，使蛋白分子質(zhì)量測(cè)量精度獲得極大的提高，并于1988年首次成功地測(cè)量了分子量為40 kD的蛋白質(zhì)分子，精確度達(dá)到99.99%。
軟激光解吸(SLD)是指從激光脈沖中獲得能量后，樣品分子以完整的低電荷分子離子釋放，然后由電場(chǎng)加速。運(yùn)用激光解吸電離蛋白分子時(shí)，激光的能量和波長(zhǎng)、化學(xué)/物理基質(zhì)的吸收和熱傳遞特性，與基質(zhì)中分析物的分子結(jié)構(gòu)之間需要作合理的選擇調(diào)配。Tanaka選用了低能量氮激光和含有膠狀顆粒的甘油作基質(zhì)，成功地測(cè)定了高分子量的糜蛋白酶原、梭膚酶-A以及細(xì)胞色素。由于Tanaka成功的開(kāi)創(chuàng)性工作，SLD技術(shù)迅速發(fā)展。目前占主導(dǎo)的方法是基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)。這一方法是將樣品摻入一種低分子量的結(jié)晶基質(zhì)，基質(zhì)的最大吸收與激光脈沖波長(zhǎng)匹配。由于MALDI產(chǎn)生的是低電荷的完整氣相大分子，可用于檢測(cè)純度不高的生物分子。MALDI與飛行時(shí)間(TOF)聯(lián)合已經(jīng)成為鑒別大分子的重要方法，成為鑒定細(xì)胞內(nèi)蛋白組分不可或缺的研究手段。
電噴霧電離(ESI)原理可按電荷殘留模型予以描述，帶電液滴蒸發(fā)，液滴變小，液滴表面相斥的靜電荷密度增大。當(dāng)液滴蒸發(fā)到某一程度，液滴表面的庫(kù)侖斥力使液滴爆炸。產(chǎn)生的小帶電液滴繼續(xù)此過(guò)程。隨著液滴的水分子逐漸蒸發(fā)，就可獲得自由徘徊的質(zhì)子化和去質(zhì)子化的蛋白分子。針對(duì)電噴霧電離所產(chǎn)生的多電荷狀態(tài)，F(xiàn)enn將多電荷狀態(tài)理解為對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行多次獨(dú)立的測(cè)量，并基于聯(lián)立方程解的平均方法，獲得對(duì)分子質(zhì)量的正確估量，解決了多電荷離子信息的問(wèn)題，使蛋白分子質(zhì)量測(cè)量精度獲得極大的提高，并于1988年首次成功地測(cè)量了分子量為40 kD的蛋白質(zhì)分子，精確度達(dá)到99.99%。
軟激光解吸(SLD)是指從激光脈沖中獲得能量后，樣品分子以完整的低電荷分子離子釋放，然后由電場(chǎng)加速。運(yùn)用激光解吸電離蛋白分子時(shí)，激光的能量和波長(zhǎng)、化學(xué)/物理基質(zhì)的吸收和熱傳遞特性，與基質(zhì)中分析物的分子結(jié)構(gòu)之間需要作合理的選擇調(diào)配。Tanaka選用了低能量氮激光和含有膠狀顆粒的甘油作基質(zhì)，成功地測(cè)定了高分子量的糜蛋白酶原、梭膚酶-A以及細(xì)胞色素。由于Tanaka成功的開(kāi)創(chuàng)性工作，SLD技術(shù)迅速發(fā)展。目前占主導(dǎo)的方法是基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)。這一方法是將樣品摻入一種低分子量的結(jié)晶基質(zhì)，基質(zhì)的最大吸收與激光脈沖波長(zhǎng)匹配。由于MALDI產(chǎn)生的是低電荷的完整氣相大分子，可用于檢測(cè)純度不高的生物分子。MALDI與飛行時(shí)間(TOF)聯(lián)合已經(jīng)成為鑒別大分子的重要方法，成為鑒定細(xì)胞內(nèi)蛋白組分不可或缺的研究手段。
