（一）聚乙二醇沉淀法質(zhì)粒ＤＮＡ
這里介紹的方法（R.Tresman,個(gè)人通訊）已卓有成效地用于純化堿裂解法制備的質(zhì)粒ＤＮＡ。
１）將核酸溶液[上頁步驟９）所得]轉(zhuǎn)入15mlＣorex 管中， 再加3ml 用冰預(yù)冷的5mol/L LiCl溶液，充分混勻，用Ｓorvall SS34 轉(zhuǎn)頭（或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭）于４℃下以10 000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。LiCl可沉淀高分子ＲＮＡ。
２）將上清轉(zhuǎn)移到另一30mlCorex管內(nèi)，加等量的異丙醇， 充分混勻，用SorvallSS34轉(zhuǎn)頭（或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)尖）于室溫以10 000轉(zhuǎn)/分離心10分釧， 回收沉淀的核酸。
３）小心去掉上清，敞開管口，將管倒置以使最后殘留的液滴流盡。于室溫用70％乙醇洗滌沉淀及管壁，流盡乙醇，用與真空裝置相連的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞開管口并將管侄置，在紙巾上放置幾分鐘，以使最后殘余的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。
４）用500μl含無ＤＮＡ酶的胰ＲＮＡ酶(20μg/ml ）的ＴＥ（pH8.0）溶解沉淀，將溶液轉(zhuǎn)到一微量離心管中，于室溫放置30分鐘。
５）加500μl含13％（w/v)聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl,充分混合，用微量離心機(jī)于４℃以12000g離心５分鐘，以回收質(zhì)粒ＤＮＡ。
６）吸出上清，用400μl TE(pH8.0)溶解質(zhì)粒ＤＮＡ沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽１次。
７）將水相轉(zhuǎn)到另一微量離心管中，加100μl 10mol/L乙醇銨，充分混勻，加２倍體積（約1ml）乙醇，于室溫放置10分鐘，于４℃以12 000g離心５分鐘，以回收沉淀的質(zhì)粒ＤＮＡ。
８）吸去上清，加200μl處于４℃以12 000g離心２分鐘。
９）吸去上清，敞開管口，將管置于實(shí)驗(yàn)桌上直到最后可見的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。
10）用500μlＴＥ（pH8.0）溶解沉淀1:100稀釋[用ＴＥ（pH8.0)] 后測(cè)量ＯＤ260，計(jì)算質(zhì)粒ＤＮＡ的濃度（１ＯＤ260＝50μg質(zhì)粒ＤＮＡ/ml）， 然后將ＤＮＡ貯于－20℃。
（二）氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心法純化閉環(huán)ＤＮＡ
１．連續(xù)梯度
１）測(cè)量ＤＮＡ溶液的體積，按lg/ml的用量精確地加入固體CsCl, 將溶液加溫至30℃助溶。溫和地混勻溶液直到鹽溶解。
２）每10mlＤＮＡ溶液加入0.8ml溴化乙錠溶液（10mg/ml溶于水）；立即將溴化乙錠溶液（漂浮在表成）與ＤＮＡ－氯化銫溶液混勻， 溶液的終密度應(yīng)為1.55g/ml（溶液的折射率為1.3860）溴化乙錠濃度應(yīng)為大約７４０μg/ml。溴化乙錠貯存液應(yīng)貯存于避光容器內(nèi)（如用錫箔完全包裹的瓶子）。于室溫保存。
３）于室溫用Sorvall SS34頭（或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭）以8000轉(zhuǎn)/分離心５分鐘， 浮在溶液上面的水垢狀浮渣是溴化乙錠和細(xì)菌蛋白所形成的復(fù)合物。
４）用巴斯德吸管或帶大號(hào)針頭的一次性注射器將浮渣下的清亮紅色溶液轉(zhuǎn)移到適用于Beckman Ti65重直轉(zhuǎn)頭或Ｔi50、Ti65或Ti70 角轉(zhuǎn)頭（或與它們相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭）
的離心管（Beckman Quick-seal或與之相當(dāng)?shù)碾x心管）中。用輕石蠟油加滿管的其余部分并封口。
５）于20℃對(duì)所得的密度梯度以45 000轉(zhuǎn)/分離心16小時(shí)（VTi65 轉(zhuǎn)頭）、 以45 000轉(zhuǎn)/分離心48小時(shí)（Ti50轉(zhuǎn)頭）、以60 000轉(zhuǎn)/分離心24小時(shí)（Ti65轉(zhuǎn)頭）或者以60 000轉(zhuǎn)/分離心24小時(shí)（Ti70.1轉(zhuǎn)頭）。在普通光照下，在梯中心可見兩條ＤＮＡ區(qū)帶， 上部區(qū)帶材料通常較少，由線狀的細(xì)菌（染色體）ＤＮＡ和帶切口的環(huán)狀質(zhì)粒ＤＮＡ組成：下部區(qū)帶則由閉環(huán)質(zhì)粒ＤＮＡ組成。管底部深紅色的沉淀是溴化乙錠ＲＮＡ復(fù)合物，位于ＣsCl溶液和石蠟油之間的是蛋白質(zhì)。Beckman Quick-Seal離心管中的CsCl－溴化乙錠梯度可容納4mg 閉環(huán)質(zhì)粒ＤＮＡ而不至超負(fù)荷。如有更大量的質(zhì)粒存在，將擴(kuò)展為一條寬帶，并與染色體ＤＮＡ相重疊。這種問題只有在質(zhì)粒復(fù)制達(dá)到極高水平時(shí)才會(huì)出現(xiàn)，只要將該質(zhì)粒提取物分為２個(gè)梯度即可解決。如出現(xiàn)負(fù)荷，可收集整個(gè)ＤＮＡ區(qū)高水平時(shí)才會(huì)出現(xiàn)，只要產(chǎn)將該質(zhì)粒提取物分為２個(gè)梯度即可解決。如出現(xiàn)超負(fù)荷，可收集整個(gè)ＤＮＡ區(qū)帶，用CsCl溶液（ρ＝1.58g/ml）將體積調(diào)到15ml，在兩個(gè)離心管中再度離心，使ＤＮＡ達(dá)到平衡。
６）收集ＤＮＡ帶。將21 號(hào)皮下注射針頭插入管的頂端以使空氣進(jìn)入，為盡量減少污染的機(jī)會(huì)，首先用１８號(hào)皮下注射針頭按下述方法收集上部的區(qū)帶（雜色體ＤＮＡ）：用乙醇小心擦拭管外壁以除去任何油脂，然后用一塊Soctch膠帶貼于管外壁。穿過Soctch膠帶將１８號(hào)皮下注身針頭（其斜面向上）斤插入管中，以便使針頭的斜面開口恰好位于染色體ＤＮＡ區(qū)帶之下并與該區(qū)帶相平行。將粘稠狀ＤＮＡ收集到一次性使用的管內(nèi)，用造型粘土塊封信皮下注射針頭的未端并將第２根針頭留于原處。 穿過Soctch 膠帶插入第３根皮下注射針頭（18號(hào)），將下部的質(zhì)粒ＤＮＡ區(qū)帶收集到玻璃或塑料管中。
２．不連續(xù)梯度
該方法是將含不同濃度CsCl的溶液分層加到離心管中，這樣可以加速CsCl梯度的形成，使離心時(shí)間減少到６小時(shí)。
１）將125gCsCl加到167ml(pH8.0)中，制成CsCl溶液（ρ＝1.47g/ml）。
２）將8ml氯化銫溶液加到Beckman Quick-Seal 離心管（或與其相當(dāng)?shù)墓埽┲�，擱置一旁等步聚８）使用。
３）如有必要，可酌情用TE(pH8.0)將質(zhì)粒ＤＮＡ溶液的體積精確地調(diào)到3ml。
４）在質(zhì)粒ＤＮＡ溶液中加入8.4gCsCl,將溶液加溫至30℃以促進(jìn)鹽溶解， 小心地混勻溶液直至鹽溶解。
５）稱量溶液重量并加入TE(pH8.0)直到溶液重量恰好達(dá)13.2g，用天平稱量時(shí)應(yīng)注意去除管的重量。
６）加入0.8ml溴化乙錠溶液（10mg/ml溶于水），快速混勻溶液直至染料均勻地分散，此時(shí)溶液瓣體積應(yīng)大約為7.5ml。溴化乙錠貯存液應(yīng)于室溫貯存在避光容器中（如完全用錫箔包裹的瓶子）。小心：溴化乙錠是一咱強(qiáng)誘變劑，并在中度毒性。
接觸含有該染料的溶液應(yīng)戴手套。
７）于室溫用Sorvall SS34轉(zhuǎn)頭（或與之相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)法）以8000轉(zhuǎn)/ 分離心５分鐘，浮在液面上的水垢狀浮渣是溴化乙錠和細(xì)菌蛋白所形成的復(fù)合物。
８）將－22.86cm的巴期德吸管放入裝有步驟２）制備的CsCl的離心管中， 吸頭應(yīng)接觸管底。用吸管小心地將步驟７所制備的清亮紅色溶液（來自浮渣之下）加入管內(nèi)，使樣本層位CsCl溶液（1.47g/ml）之下。如有必要，可酌情步驟１）中制備的CsCl溶液（ρ=1.47g/ml)添滿離心管，封口。
９）將封口的管，（與相應(yīng)的平衡管一起）放入Beckman Ti70. 1 或Sorvall65.13轉(zhuǎn)頭（或與之相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭中），于20℃以60 000轉(zhuǎn)/分將密度梯度離心６小時(shí)。
10）回收閉環(huán)質(zhì)粒ＤＮＡ區(qū)帶
（三）從經(jīng)過純化的質(zhì)粒ＤＮＡ中去除溴化乙錠
下面方法對(duì)于從經(jīng)過氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心純化的ＤＮＡ中去除溴化乙錠都同樣奏效。
方法：有機(jī)溶劑抽提
小心：溴化乙錠是一種強(qiáng)誘變劑，并有中度毒性。接觸含有該染料的溶液應(yīng)戴手套。用后這些溶液應(yīng)用后述的方法進(jìn)行凈化處理。
１）將ＤＮＡ溶液放入玻璃或塑料管中，加等體積的水飽和１－丁醇或異戊醇。
２）振蕩混合兩相。
３）用臺(tái)式離心機(jī)于室溫以1500轉(zhuǎn)/分離心３分鐘。
４）用巴期德吸管將下層水相移至一干凈的玻璃或塑料管內(nèi)。
５）反復(fù)抽提[步驟１）－４）]４－６次直到粉紅色從水相和有機(jī)相中均消失。
６）用以下任意一種方法從ＤＮＡ溶液中除CsCl：通過微量濃縮器（Amicon）進(jìn)行旋轉(zhuǎn)透析，對(duì)TE(pH8.0)透析24-48小時(shí)，并換液數(shù)次或者用３倍體積水進(jìn)行稀釋并于４℃用２倍體積乙醇（即終體積相當(dāng)于原未稀釋體積的６倍）沉淀Ｄ15分鐘，再于４℃以10 000g 離心15 分釧， 將沉淀的ＤＮＡ溶于約1ml TE(pH8.0)中。如將ＤＮＡ的乙醇溶液置于-20℃，CsCl會(huì)沉淀。
７）測(cè)定ＤＮＡ終溶液的ＯＤ260值，計(jì)算ＤＮＡ的濃度， 將ＤＮＡ分成小份貯存于-20℃。如果終制備的ＤＮＡ含有顯著量的溴化乙錠（依顏色判斷），可用酚、酚：氯仿各抽提１次，然后用乙醇沉淀ＤＮＡ。
（四）溴化乙錠溶液的凈化處理
小心：溴化乙錠是強(qiáng)誘變劑，并有中度毒性，取用含有這一染料的溶液時(shí)務(wù)必戴上手套，這些溶液經(jīng)使用應(yīng)按下面介紹的方法進(jìn)行凈化處理。
１．溴化乙錠濃溶液（即濃度>0.5gm/ml的溴化乙錠沉溶液）的凈化處理
方法： 用少門氏菌－微粒體測(cè)定表明， 本方法（Lunn 和Sanaone,1987）可使溴化乙錠的誘變活性降低至原來的1/200左右。
１）加入足量的水使溴化乙錠的濃度降低至0.5mg/ml以下。
２）加入0.2體積新配制的５％次磷酸和0.12體各新配制的0.5mol/L 亞硝酸鈉，混勻。
切記：檢測(cè)該溶液的pH值應(yīng)小于3.0。市售次磷酸一般為50％溶液，具有腐蝕性，應(yīng)小心操作，必須現(xiàn)用現(xiàn)稀釋。亞硝酸鈉溶液（0.5mol/L）應(yīng)用水溶解34.5g亞硝酸鈉并定容至終體積500ml，現(xiàn)用現(xiàn)配。
３）于室溫溫育24小時(shí)后，加入大大過量的1ml/L碳酸氫鈉。至些， 該溶液可予丟棄。返回
切記：檢測(cè)該溶液的pH值應(yīng)小于3.0。市售次磷酸一般為50％溶液，具有腐蝕性，應(yīng)小心操作，必須現(xiàn)用現(xiàn)稀釋。亞硝酸鈉溶液（0.5mol/L）應(yīng)用水溶解34.5g亞硝酸鈉并定容至終體積500ml，現(xiàn)用現(xiàn)配。
３）于室溫溫育24小時(shí)后，加入大大過量的1ml/L碳酸氫鈉。至些， 該溶液可予丟棄。
(五）從質(zhì)粒ＤＮＡ制品中去除ＲＮＡ
對(duì)于某些用途（例如用ＢＡＬ31進(jìn)生活化或用Ｔ４噬菌體多核苷酸激酥標(biāo)記質(zhì)粒ＤＮＡ的限制切片段的５'端），必須獲得無ＲＮＡ污染的ＤＮＡ制品。盡管在通過氯化銫－化乙錠梯度平衡離心所制備的質(zhì)粒ＤＮＡ中，這樣的ＲＮＡ污染物的重量微不卟道，但對(duì)說來，其中的ＲＮＡ分子數(shù)卻可能相當(dāng)可觀，并可在限制酶消化反應(yīng)的全部５'端中占據(jù)砂容忽視的比例。通過下述方法，可以從質(zhì)粒制品中去除ＲＮA 。
２．通過Bio-Gel A-150m或Sepharose CL-4B進(jìn)行層析
１）制備質(zhì)粒ＤＮＡ。
２）有等體積的經(jīng)TE(pH8.0)平衡后的酚抽提１次。
３）將至多1ml的水相鋪在經(jīng)TE(pH8.0)和0.1％ＳＤＳ平衡的Bio-Gel A-150m或Sepharase CL-4B(1x10cm)柱上。
４）將ＤＮＡ裝入層柱并在柱的上部連接上含0.1％ＳＤＳ的TE(pH8.0)的貯液瓶，立即開始以0.5ml流出液為１流進(jìn)行收集。
５）當(dāng)收集到15份時(shí)，關(guān)閉柱底部，為明確質(zhì)粒ＤＮＡ的分布情況，可心眾每份收集物中取10μg樣品，通過0.7％瓊脂糖凝膠電泳或溴化乙錠熒光（見附錄Ｅ）進(jìn)行分析。
６）將含質(zhì)粒ＤＮＡ的組成合并在一起，加２倍體積的乙醇于４℃沉淀10分鐘，然后于４℃以大于10 000g離心15分鐘，以回收ＤＮＡ。
