（一）濾膜的準(zhǔn)備
提取基因組（染色體）DNA
用適當(dāng)限制性內(nèi)切酶（如BamHI、EcoRI、HindIII或Pst I）消化DNA，
重蒸水 11µl
基因組DNA 5µl（3-5µg）
10×緩沖液 2µl
限制性內(nèi)切酶 2µl
總量為20µl
3. 37℃條件下保溫10-24小時(shí)。
4. 取2µl樣品在0.7-1%凝膠上在TBE溶液中進(jìn)行電泳檢查。
5.確定后，樣品與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)一起膠電泳。
6.電泳結(jié)束后，在凝膠的側(cè)沿放一把直尺進(jìn)行拍照，并做標(biāo)號(hào)。
7.將電泳凝膠用蒸餾水沖洗后，放入100ml depurination solution中，室溫條件下緩慢振動(dòng)浸泡15min。（膠顯黃色)
8.凝膠蒸餾水沖洗后，轉(zhuǎn)移到100ml 變性溶液中緩慢振動(dòng)浸泡20分鐘，換新的變性溶液，再振動(dòng)浸泡20分鐘。（膠顯藍(lán)色）
9.水洗凝膠后，轉(zhuǎn)移到中和溶液緩慢振動(dòng)浸泡15，然后換溶液后，再浸泡15min。
10.毛細(xì)管作用，將DNA從瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上。
取出雜交尼龍膜，在其上面做上記號(hào)，在6×SSC溶液中非常緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)條件下清洗5min。（含有DNA面朝上）將其從溶液中取出，放在Whatman 3MM濾紙上，讓其自然風(fēng)干。 夾在兩張濾紙中，放在80℃條件下烘烤2小時(shí)，使其完全固定。
（二）探針的標(biāo)記
1、取10ng-30g DNA,，用雙蒸水定容至15μl.
2、在沸水浴中變性DNA 10 min，迅速放入冰浴中。
3、在變性DNA中添加下列試劑
六聚寡核苷酸 2μl
dNTP標(biāo)記混合物 2μl
Klenow enzyme 1μl
總體積20μl
4、混勻、少許離心后，在37℃條件下培養(yǎng)。
5、添加2μl的0.2 EDTA（PH8.0）,或者65℃加熱10分鐘終止反應(yīng)。
（三）雜交：
1、預(yù)熱適當(dāng)體積的DIG Easy Hyb (2ml/100cm2膜)
2、在合適的容器中，預(yù)雜交膜30min，柔和搖動(dòng)，預(yù)雜交。
3、在沸水浴中5min，變性大約25mg/ml的DIG標(biāo)記DNA探針，然后迅速在冰浴中冷卻。
4、倒去雜交液，添加探針和雜交液到膜，在緩慢振動(dòng)情況下保溫雜交6h或者過夜。
5、用洗液Ⅰ（2*ssc,0.1℅SDS）在室溫條件下洗2次，每次15min。
6、用預(yù)熱的洗液Ⅱ（0.5*ssc,0.1℅SDS），在65-68℃的條件下，搖動(dòng)洗2次，每次15min。
（四）免疫檢測(cè)：
1、 雜交后，洗液中漂洗膜1-5min
2、 在100ml終止液中（blocking solution）,保溫30min。
3、 在200ml抗體溶液（Antibody solution）中保溫30min。
4、 用100ml洗液洗2次，每次15min。
5、 用20ml檢測(cè)液平衡2-5min。
6、 在黑暗中，加10ml colorsubstrate 溶液于適當(dāng)容器中，保溫。在顯色的過程中不要搖動(dòng)。（淡色的反應(yīng)開始在幾秒鐘，在16小時(shí)后完全反應(yīng)）
7、 膜曝光后短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)顯色
8、 用ddH2O或者TE buffer洗膜，終止反應(yīng)。
