雙向凝膠電泳的原理是第一向基于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同用SDS-PAGE分離，把復(fù)雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開。近年來經(jīng)過多方面改進(jìn)已成為研究蛋白質(zhì)組的最有使用價(jià)值的核心方法。
分離蛋白質(zhì)組所有蛋白的兩個(gè)關(guān)鍵參數(shù)是其分辨率和可重復(fù)性。在目前情況下，雙向凝膠電泳的一塊膠板（16cm×20cm）可分出3～4千個(gè)，甚至1萬個(gè)可檢測的蛋白斑點(diǎn)，這與10萬個(gè)基因可表達(dá)的蛋白數(shù)目相比還是太少了。80年代開始采用固定化pH梯度膠，克服了載體兩性電解質(zhì)陰極漂移等許多缺點(diǎn)而得以建立非常穩(wěn)定的可以隨意精確設(shè)定的pH梯度。由于可以建立很窄的pH范圍（如0.05U/cm)，對特別感興趣的區(qū)域可在較窄的pH范圍內(nèi)做第二輪分析，從而大大提高了分辨率。此種膠條已有商品生產(chǎn)，因此基本上解決了雙向凝膠電泳重復(fù)性的問題。這是雙向凝膠電泳技術(shù)上的一個(gè)非常重要的突破。第二向SDS-PAGE有垂直板電泳和水平超薄膠電泳兩種做法，可分離10～100kD分子量的蛋白質(zhì)。
其中靈敏度較高的銀染色法可檢測到4ng蛋白，最靈敏的還是用同位素標(biāo)記，20ppm的標(biāo)記蛋白就可通過其熒光或磷光的強(qiáng)度而測定。用圖像掃描儀、萊賽密度儀、電荷組合裝置可把用上述方法得到的蛋白圖譜數(shù)字化，再經(jīng)過計(jì)算機(jī)處理，去除縱向和橫向的曳尾以及背景底色，就可以給出所有蛋白斑點(diǎn)的準(zhǔn)確位置和強(qiáng)度，得到布滿蛋白斑點(diǎn)的圖像，即所謂“參考膠圖譜”。蛋白質(zhì)組研究的主要困難是對用雙向凝膠電泳分離出來的蛋白，進(jìn)行定性和定量的分析。最常用的方法是先把膠上的蛋白印跡到PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上后再進(jìn)行分析，確定它們是已知還是未知蛋白。現(xiàn)在的分級(jí)分析法是先做快速的氨基酸組成分析，也可先做4～5個(gè)循環(huán)的N末端微量測序，再做氨基酸組成分析；結(jié)合在電泳膠板上估計(jì)的等點(diǎn)電和分子量，查對數(shù)據(jù)庫中已知蛋白的數(shù)據(jù)，即可作出判斷。有文獻(xiàn)報(bào)道，N末端4個(gè)殘基序列的數(shù)據(jù)就可以給出很多的信息而得到相當(dāng)準(zhǔn)確的結(jié)果。如再結(jié)合C末端序列，判斷結(jié)果的準(zhǔn)確性會(huì)更高。對分離得到的蛋白質(zhì)作進(jìn)一步的確切鑒定需要有足夠數(shù)量的純蛋白，電泳時(shí)蛋白質(zhì)已經(jīng)過了高度純化。現(xiàn)在一塊膠板可允許上到高達(dá)mg數(shù)量級(jí)的樣品，因此每個(gè)分離的蛋白斑點(diǎn)可有μg數(shù)量的蛋白，這樣使本來是微量的蛋白也可希冀被鑒定。
蛋白質(zhì)的翻譯后修飾和加工，是指在肽鏈合成完成后進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)，如磷酸化、羥基化、糖基化、二硫鍵形成，以及最近發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)自剪接等等，可能有一百種以上。翻譯后修飾和加工對蛋白質(zhì)的正常生理功能是必需的，它們的變化往往和疾病的發(fā)生有關(guān)。用雙向凝膠電泳可以進(jìn)行翻譯后修飾的研究，如用32P標(biāo)記可以研究磷酸化蛋白的變化。雙向凝膠電泳中�？砂l(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)拖曳現(xiàn)象，很可能是一個(gè)蛋白的不同翻譯后修飾產(chǎn)物所造成的。拖曳圖像變化在疾病診斷上可能提供重要的信息。
雙向凝膠電泳技術(shù)當(dāng)前面臨的挑戰(zhàn)是：(1)低拷貝蛋白的鑒定。人體的微量蛋白往往還是重要的調(diào)節(jié)蛋白。除增加雙向凝膠電泳靈敏度的方法外，最有希望的還是把介質(zhì)輔助的激光解吸/離子化質(zhì)譜用到PVDF膜上，但當(dāng)前的技術(shù)還不足以檢出拷貝數(shù)低于1000的蛋白質(zhì)。(2)極酸或極堿蛋白的分離。(3)極大（＞200kD）或極�。ǎ�10kD＝蛋白的分離。(4)難溶蛋白的檢測，這類蛋白中包括一些重要的膜蛋白。(5)得到高質(zhì)量的雙向凝膠電泳需要精湛的技術(shù)，因此迫切需要自動(dòng)二維電泳儀的出現(xiàn)。
