將樣品在電泳前標(biāo)記Cy2、Cy3 和Cy5 這3 種熒光染料,然后將標(biāo)記后的3 種樣品混合, 同時(shí)在一塊膠上進(jìn)行電泳,即為差異凝膠電泳(DIGE) 。所得到的2D 膠圖像可使用3 種不同的激發(fā)P發(fā)射過(guò)濾器得到不同顏色熒光信號(hào),根據(jù)這些信號(hào)的比例來(lái)判斷樣品之間蛋白質(zhì)的差異,這樣可避免在匹配時(shí)出現(xiàn)的誤差,進(jìn)行定量分析時(shí)也不依賴(lài)于膠與膠之間的重復(fù)性。用于標(biāo)記的熒光基團(tuán)在化學(xué)結(jié)構(gòu)上相似,分子量也基本相同,都帶有正電荷,所以在與賴(lài)氨酸殘基反應(yīng)時(shí),保證了所有的樣品可以移至相同的位置。該方法的靈敏度可與銀染和SYPRO Ruby 相媲美, 可檢測(cè)到100～200pg 的蛋白質(zhì),線形動(dòng)態(tài)范圍在5 倍左右。已有很多文獻(xiàn)證明該方法的靈敏性和重復(fù)性,如用該方法研究苯甲酸對(duì)大腸桿菌的抑制作用和食道癌的特征蛋白。該方法也提高了定量上的準(zhǔn)確性。由于實(shí)驗(yàn)方法本身造成的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)強(qiáng)度的差異,比如樣品在進(jìn)入膠條時(shí)會(huì)有一些樣品損失,但在同一塊差異凝膠電泳膠上就不會(huì)出現(xiàn)這樣的差異。目前出現(xiàn)了一種改良了的DIGE 技術(shù)使其更好的進(jìn)行定量分析, 該技術(shù)將Cy2 作為用Cy3、Cy5 標(biāo)記的蛋白質(zhì)內(nèi)標(biāo), 用以比較數(shù)據(jù)庫(kù)中各個(gè)膠之間的蛋白質(zhì)的量的差異。DIGE 可在同一次檢測(cè)中通過(guò)分析單一膠上的相互覆蓋的信息來(lái)得到蛋白質(zhì)的信息,可以同時(shí)在一塊膠上在相同電泳條件下分離2～3 個(gè)樣品,大大減少了一個(gè)實(shí)驗(yàn)需要的膠的總數(shù) 。
雖然從理論上來(lái)說(shuō),該方法非常誘人, 但DIGE 本身還有很多技術(shù)上的問(wèn)題。如:1) 只有當(dāng)約1 %～2 %的蛋白質(zhì)的賴(lài)氨酸殘基在熒光標(biāo)記時(shí)修飾,才可以維持被標(biāo)記的蛋白在電泳時(shí)的溶解性;2) 在DIGE 染色中丟失的蛋白質(zhì)基本確定為樣品中的低豐度蛋白; 3) 雖然經(jīng)染色后在電荷上未發(fā)生變化,被染料標(biāo)記的蛋白質(zhì)比未標(biāo)記的蛋白質(zhì)點(diǎn)向大分子方向有輕微遷移,主要是由于熒光團(tuán)的加入。這使得在標(biāo)記的和未標(biāo)記蛋白之間產(chǎn)生95 %的誤差, 之后在質(zhì)譜分析時(shí)產(chǎn)生更多的復(fù)雜問(wèn)題�？赏ㄟ^(guò)再染色的方法以使割點(diǎn)的步驟不出錯(cuò)。但考馬斯亮藍(lán)染色比DIGE 染色方法靈敏度低,有約40 %的興趣蛋白質(zhì)點(diǎn)不能從考馬斯亮藍(lán)染色的膠上被發(fā)現(xiàn)。因此,高靈敏度的染色方法SYPRO Ruby 被用于作為DIGE 后染色的方法。4) 另一個(gè)值得注意的影響靈敏度的問(wèn)題是熒光物質(zhì)在激發(fā)P發(fā)射過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)信號(hào)的相互干擾。引發(fā)Cy3 的激發(fā)波長(zhǎng)有時(shí)可引起Cy5 標(biāo)記的蛋白發(fā)射。
雖然從理論上來(lái)說(shuō),該方法非常誘人, 但DIGE 本身還有很多技術(shù)上的問(wèn)題。如:1) 只有當(dāng)約1 %～2 %的蛋白質(zhì)的賴(lài)氨酸殘基在熒光標(biāo)記時(shí)修飾,才可以維持被標(biāo)記的蛋白在電泳時(shí)的溶解性;2) 在DIGE 染色中丟失的蛋白質(zhì)基本確定為樣品中的低豐度蛋白; 3) 雖然經(jīng)染色后在電荷上未發(fā)生變化,被染料標(biāo)記的蛋白質(zhì)比未標(biāo)記的蛋白質(zhì)點(diǎn)向大分子方向有輕微遷移,主要是由于熒光團(tuán)的加入。這使得在標(biāo)記的和未標(biāo)記蛋白之間產(chǎn)生95 %的誤差, 之后在質(zhì)譜分析時(shí)產(chǎn)生更多的復(fù)雜問(wèn)題�？赏ㄟ^(guò)再染色的方法以使割點(diǎn)的步驟不出錯(cuò)。但考馬斯亮藍(lán)染色比DIGE 染色方法靈敏度低,有約40 %的興趣蛋白質(zhì)點(diǎn)不能從考馬斯亮藍(lán)染色的膠上被發(fā)現(xiàn)。因此,高靈敏度的染色方法SYPRO Ruby 被用于作為DIGE 后染色的方法。4) 另一個(gè)值得注意的影響靈敏度的問(wèn)題是熒光物質(zhì)在激發(fā)P發(fā)射過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)信號(hào)的相互干擾。引發(fā)Cy3 的激發(fā)波長(zhǎng)有時(shí)可引起Cy5 標(biāo)記的蛋白發(fā)射。
