1．DNA的變性解鏈?zhǔn)请s交成功的關(guān)鍵,Southern印跡雜交時DNA在凝膠中變性,變性方法是將凝膠浸在數(shù)倍體積的1.5mol/L
NaCl和0.5mol/L NaOH中1小時，然后用數(shù)倍體積的1mol/L Tris-HCl （pH8.0）和1.5mol/L NaCl溶液中和1小時。DNA受酸、堿、熱等處理均能發(fā)生變性，但強(qiáng)酸會使核酸降解。堿變性可避免DNA的降解、熱變性要在低DNA濃度（100μg/ml）和低鹽濃度（0.1 SSC 15mmol/L NaOH，1.5mmol/L檸檬酸三鈉，pH7.0)下進(jìn)行。用SSC稀釋DNA溶液為50μg/ml，加10mol/L NaOH使最終濃度為0.1mol/L（pH約12.8），室溫變性10min，很快置冰鹽水中，用10mol/L HC1或5mol/L NaH2PO4調(diào)pH到7-8(亦可用堿變性后，調(diào)至中性，再加熱100℃后，調(diào)至中性，或只加熱100℃10min)。DNA變性可用OD260增加（約30-40%）來檢測，變性DNA醇沉淀呈雪樣，完全失去纖維狀沉淀。變性后加入等量冷的12×SSC，冰溶保存。
2．變性DNA在硝酸纖維素膜上的固定。硝酸纖維素濾膜（孔徑0.45um）先在蒸餾水中充分浸泡，再用6SSC浸泡30min～2h，涼干，DNA樣品轉(zhuǎn)移或加至硝酸纖維素膜上后，先室溫干燥4h，然后再在80℃真空干燥2h。
3．預(yù)雜交。濕潤的濾膜放入可加熱封口的塑料袋中，按每平方厘米膜加0.2ml預(yù)熱至60℃的預(yù)雜交液（6×SSC，0.5%SDS，5×Denhardt液，100μg/ml鮭魚精DNA）。鮭魚精DNA需經(jīng)過剪切和DNA酶消化處理，然后酒精沉淀純化，調(diào)濃度至10μg/ml，用前放100℃水溶液中煮沸變性10min，冰水驟冷。盡可能將袋中氣泡趕盡，用封口器將袋口封住。將雜交袋浸入68℃水浴中保溫3-12h，當(dāng)預(yù)雜交液溫度升至68℃時，在濾膜表面常會形成水氣泡，輕輕晃動袋中液體即可除去這些小氣泡，這一點對于保證濾膜表面充分浸潤預(yù)雜交液很重要。
4．雜交。
從水浴中取出塑料袋，用剪刀剪開一角，盡可能擠凈預(yù)雜交液，用吸管或大槍頭將雜交液加入袋中，用恰好足量的液體保持濾膜濕潤（50ul/cm2）。溶液的組成是6×SSC，0.01mol/L EDTA，變性的標(biāo)記核酸探針，5×Denhardt液，0.5%SDS，100mg/ml變性的鮭魚精DNA。盡可能趕盡氣泡后，將塑料袋嚴(yán)密封口。雜交反應(yīng)在68℃水浴中進(jìn)行，所需時間視探針和檢測靶DNA的性質(zhì)及探針的比活性等情況而定，一般為4-20h。
5．洗膜。取出塑料袋，用剪刀剪開，小心取出濾膜，立即浸入盛有2×SSC和0.5%
SDS溶液的盤中,室溫下漂洗5min,再將濾膜移入2×SSC和0.1%
SDS中,室溫下洗滌15分鐘(輕輕搖動),然后將濾膜移入0.1%×SSC和0.5%×SDS溶液中,68℃輕輕搖動保溫2h，更換緩沖液后繼續(xù)保溫30min。 洗脫的溫度一般應(yīng)控制在Tm值12℃以下，[Tm=69.3 0.41×(G C）%]，雙鏈DNA的Tm值隨錯配堿基對數(shù)每增加1%而遞減1℃。
6．結(jié)果顯示。放射性測定方法，固相膜的放射性雜交結(jié)果顯示有兩種方式，一是放射自顯影法、另一是液閃計數(shù)法，放射自顯影法比較簡單，只需將雜交膜與X光片在暗盒中暴光數(shù)小時至數(shù)天，再顯影，定影即可。對于雜交信號較強(qiáng)的固相膜，用一塊增敏屏可顯著增強(qiáng)暴光強(qiáng)度。此外，為了減弱32P的放射，暴光通常在-20℃或-
80℃下進(jìn)行。液閃計數(shù)法主要用于斑點和狹縫雜交及為了比較兩個雜交信號的強(qiáng)弱等情形，方法是將完成雜交的膜在漂洗結(jié)束后剪成小塊（每份樣品1塊），80℃真空干燥后裝閃爍瓶，加入2—5 ml閃爍液，剪2-3塊無樣品作為本底對照，在液體閃爍計數(shù)器上自動計數(shù)，液體計數(shù)測定放射性強(qiáng)度也可以在放射自顯影之后進(jìn)行。
