通過(guò)體外無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)翻譯找出目的基因mRNA以后，變可進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，其步驟包括：
1）在Ependorf管中加50pmol/L的一種α32PdNTP和1mg/ml的mRNA 10μl（10μg），100m mol/L甲基氫氧化汞1μl，室溫反應(yīng)l0分鐘，使RNA變性。
2)加100m mol/L的β-巰基乙醇2μl和10m mol/L RNA酶抑制劑2μl，室溫放置5分鐘。β-巰基乙醇有穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶活性的作用。
3)向上述反應(yīng)混合物加lmg／ml的引物01igo dT(12～18聚體)10μl，1mol／L Tris.HCl(pH8.3)5μl，11mol／L KCl7μl，250m mol／L MgCl22μl，再加20 m mol／L的4種dNTP各2.5μl，逆轉(zhuǎn)錄酶2μl（40單位），用水補(bǔ)充到50μl，充分混勻，42℃反應(yīng)1～3小時(shí)。
4)加0.5 EDTA(pH8.0)2μl終止反應(yīng)，然后加150m mol／L NaOH 25μl，65℃反應(yīng)1小時(shí)，或37℃8小時(shí)，水解mRNA模板，得到cDNA第一鏈，再加pH8.0，1m mol／L Tris.HCl，各25μl中和其pH。
5)測(cè)定放射活性，計(jì)算合成的DNA量。實(shí)際上，cDNA第一鏈的產(chǎn)量往往不會(huì)超過(guò)poltAmRNA用量的10%～30%。
6)用等體積的酚-氯仿抽提—次，取水相并用SephadexG-100離心柱層析(參看第6章)將cDNA同剩余的dNTP分開(kāi)，以2.5倍體積的95％冷乙醇沉淀。
7)合成的cDNA第—鏈在1.4％的堿性瓊脂糖凝膠上電泳，用末端標(biāo)記的pBR322限制性片段為分子量標(biāo)準(zhǔn)，電泳后，鋪X-光片，進(jìn)行放射自顯影，確定cDNA第一鏈的大小。
