亞克隆的基本過程包括：(1)目的DNA片段和載體的制備；(2)目的DNA片段和載體的連接；(3)連接產物的轉化；(4)重組子篩選。
一、試劑準備
1．LB液體培養(yǎng)基：胰化蛋白胨（細菌培養(yǎng)用）10g，酵母提取物（細菌培養(yǎng)用） 5g，NaCl 10g，加ddH2O 至1000ml，完全溶解，分裝小瓶，15lbf/in2高壓滅菌20min。
2．1.5%瓊脂LB固體培養(yǎng)基: 稱取1.5g瓊脂粉放入300ml錐形瓶,加100ml LB，15 lbf/in2 高壓滅菌20min，稍冷卻，制備平皿。
3．IPTG、X-Gal
4．0.1M MgCl2 ：15 lbf/in2高壓滅菌20min，0℃冰浴備用。
5．0.1M CaCl2（以20%甘油水溶液配制）：15 lbf/in2高壓滅菌20min，0℃冰浴備用。
6．限制性核酸內切酶、T4 DNA連接酶。
二、目的DNA片段和載體的制備
選擇適宜的限制性核酸內切酶，消化已知目的DNA和載體，獲得線性DNA，用于重組。根據(jù)目的DNA和載體的具體情況，選擇一種或者兩種適當?shù)南拗泼盖懈�，分別產生對稱性粘性末端（用一種限制性內切酶進行消化而產生帶有互補突出端）、不對稱粘性末端（用兩種不同的限制性內切酶進行消化而產生帶有非互補突出端）、平端。在亞克隆時，首選不對稱相容末端連接，次選對稱性粘性相容性末端連接，由于平末端連接效率較低，通常很少采用。但有時目的片段的末端與載體不匹配 ，一般先將不匹配末端補平，然后再以平末端連接。
三、利用T4 DNA連接酶進行目的DNA片段和載體的體外連接
（一）連接要求和結果
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外源DNA片段末端性質
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連接要求
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連接結果
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不對稱粘性末端
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兩種限制酶消化后，需純化載體以提高連接效率
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載體與外源DNA連接處的限制酶切位點�？杀Ａ�；非重組克隆的背景較低；外源DNA可以定向插入到載體中。
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對稱性粘性末端
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線形載體DNA常需磷酸酶脫磷處理
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載體與外源DNA連接處的限制酶切位點�？杀Ａ�；重組質粒會帶有外源DNA的串聯(lián)拷貝；外源DNA會以兩個方向插入到載體中。
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平端
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要求高濃度的DNA和連接酶
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載體與外源DNA連接處的限制酶切位點消失；重組質粒會帶有外源DNA的串聯(lián)拷貝；非重組克隆的背景較高 。
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帶有相同末端(平端或粘端)的外源DNA片段必須克隆到具有匹配末端的線性質粒載體中,但是在連接反應時,外源DNA和質粒都可能發(fā)生環(huán)化,也有可能形成串聯(lián)寡聚物。因此，必須仔細調整連接反應中兩個DNA 的濃度，以便使“正確”連接產物的數(shù)量達到最佳水平，此外還常常使用堿性磷酸酶去除5’磷酸基團以抑制載體DNA的自身環(huán)化。利用T4 DNA連接酶進行目的DNA片段和載體的體外連接反應，也就是在雙鏈DNA 5’磷酸和相鄰的3’羥基之間形成新的共價鍵。如載體的兩條鏈都帶有5’磷酸（未脫磷），可形成4個新的磷酸二酯鍵；如載體DNA已脫磷，則只能形成2個新的磷酸二酯鍵，此時產生的重組DNA帶有兩個單鏈缺口，在導入感受態(tài)細胞后可被修復。
（二）T4 DNA連接酶對目的DNA片段和載體連接的一般方案
1．連接反應一般在滅菌的0.5ml離心管中進行。
2．10μl體積反應體系中：取載體50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般線性載體DNA分子與外源DNA分子摩爾數(shù)為1∶1-1∶5），補足ddH2O 至8μl。
3．輕輕混勻，稍加離心，56℃水浴5min后，迅速轉入冰浴。
4．加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA連接酶合適單位， 用ddH2O 補至10μl，稍加離心，在適當溫度（一般14-16℃水�。┻B接8-14hr。
四、連接產物的轉化
1.感受態(tài)細胞的制備
⑴ 保存于-70℃的DH5α（或其他菌種）用接種環(huán)劃菌于1.5%瓊脂平板上，37℃恒溫倒置培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)（約14-16 hr）。
⑵ 挑取單菌落，接種于2.0ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫，250g振蕩培養(yǎng)過夜（約12hr）。
⑶ 取0.5ml 過夜培養(yǎng)液，接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2-2.5hr，至OD600為0.4-0.5時，放置于4℃冰箱冷卻1-2hr。
（注：以下操作均應在冰浴中進行。）
⑷ 將培養(yǎng)液分入兩個50ml離心管中，4℃離心，4000g×10min，棄去上清，用冰浴的0.1M MgCl2 25ml懸浮30min。
⑸ 4℃離心,4000g×10min，棄去上清，加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液1ml懸浮。
⑹ 以100μl/管分裝入1.5ml離心管中，-70℃凍存?zhèn)溆谩?br />注：此法制備感受態(tài)細胞，可使每微克超螺旋質粒DNA產生5×106-2×107個菌落，這樣的轉化效率足以滿足所有在質粒中進行的常規(guī)克隆的需要，制備的感受態(tài)細胞可貯存于-70℃，但保存時間過長會使轉化效率在一定程度上受到影響，一般三個月以內轉化效率無多大改變。
2. 連接產物的轉化
⑴ 取100μl貯存于-70℃鈣化菌，冰浴化開；
⑵ 加入適量連接產物（一般不超過10μl，輕輕混勻，冰浴20min；
⑶ 于42℃熱休克90s，迅速轉移至冰浴中，繼續(xù)冰浴2-3min；
⑷ 加入LB液體培養(yǎng)基200μl，于37℃緩搖孵育45min；
⑸ 將培養(yǎng)物適量涂于1.5%瓊脂LB平板（根據(jù)質粒性質添加抗生素或/和X-Gal/IPTG），待膠表面沒有液體流動時，37℃溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr。
五、重組子的篩選
根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子，如α-互補、抗生素基因等�，F(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌的DNA的短區(qū)段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點（MCS），它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞。因此，宿主和質粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時存在時，可形成具有酶學活性的蛋白質。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質粒之間實現(xiàn)了互補，稱為α-互補。由α-互補而產生的LacZ 細菌在誘導劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時產生藍色菌落，因而易于識別。然而，當外源DNA插入到質粒的多克隆位點后，幾乎不可避免地導致無α-互補能力的氨基端片段，使得帶有重組質粒的細菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍白斑篩選。如用藍白斑篩選則經(jīng)連接產物轉化的鈣化菌平板37℃溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr后，有重組質粒的細菌形成白色菌落。
六、注意事項
1. 目的DNA片段制備、回收、純化時，應避免外來DNA污染。
2. 不同廠家生產的T4 DNA連接酶反應條件稍有不同，但其產品說明書上均有最適反應條件，包括對不同末端性質DNA分子連接的T4 DNA連接酶的用量、作用溫度、時間等。同時提供有連接酶緩沖液（10×、5×、2×），其中多已含有要求濃度的ATP，應避免高溫放置和反復凍融使其分解。
2. 連接產物的轉化：細菌細胞經(jīng)特殊試劑處理后在適當?shù)臈l件下具有接收外源DNA的能力，因此可將上述連接產物通過熱刺激或電脈沖轉化感受態(tài)細胞，當細菌大量增殖的同時，導入的重組DNA也得到增殖。
3. 制備感受態(tài)細胞所用離心管、培養(yǎng)瓶最好經(jīng)酸堿處理或使用新的，15 lbf/in2高壓滅菌20min。
5. 白色菌落中重組質粒內插入片段是否是目的片段需通過鑒定。
