Southern雜交可用來(lái)檢測(cè)經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后的DNA片段中是否存在與探針同源的序列,它包括下列步驟:
(1) 酶切DNA, 凝膠電泳分離各酶切片段,然后使DNA原位變性。
(2) 將DNA片段轉(zhuǎn)移到固體支持物(硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)上。
(3) 預(yù)雜交濾膜,掩蓋濾膜上非特異性位點(diǎn)。
(4) 讓探針與同源DNA片段雜交,然后漂洗除去非特異性結(jié)合的探針。
(5) 通過(guò)顯影檢查目的DNA所在的位置。
Southern雜交能否檢出雜交信號(hào)取決于很多因素,包括目的DNA在總DNA中所占的比例、探針的大小和比活性、轉(zhuǎn)移到濾膜上的DNA量以及探針與目的DNA間的配對(duì)情況等。在最佳條件下,放射自顯影曝光數(shù)天后, Southern雜交能很靈敏地檢測(cè)出低于0.1pg與32 P標(biāo)記的高比活性探針的(>109 cpm/μg)互補(bǔ)DNA。如果將10μg基因組DNA轉(zhuǎn)移到濾膜上，并與長(zhǎng)度為幾百個(gè)核苷酸的探針雜交,曝光過(guò)夜,則可檢測(cè)出哺乳動(dòng)物基因組中1kb大小的單拷貝序列。
將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)移到固體支持物上的方法主要有3種:(1)毛細(xì)管轉(zhuǎn)移。本方法由Southern發(fā)明,故又稱為Southern轉(zhuǎn)移(或印跡)。毛細(xì)管轉(zhuǎn)移方法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單,不需要用其他儀器。缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)移時(shí)間較長(zhǎng),轉(zhuǎn)移后雜交信號(hào)較弱。(2)電泳轉(zhuǎn)移。將DNA變性后,可電泳轉(zhuǎn)移至帶電荷的尼龍膜上。該法的優(yōu)點(diǎn)是不需要脫嘌呤/水解作用,可直接轉(zhuǎn)移較大的DNA片段。缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)移中電流較大,溫度難以控制。通常只有當(dāng)毛細(xì)管轉(zhuǎn)移和真空轉(zhuǎn)移無(wú)效時(shí),才采用電泳轉(zhuǎn)移。(3) 真空轉(zhuǎn)移。有多種真空轉(zhuǎn)移的商品化儀器,它們一般是將硝酸纖維素膜或尼龍膜放在真空室上面的多孔屏上,再將凝膠置于濾膜上,緩沖液從上面的一個(gè)貯液槽中流下,洗脫出凝膠中的DNA,使其沉積在濾膜上。該法的優(yōu)點(diǎn)是快速,在30分鐘內(nèi)就能從正常厚度(4-5mm)和正常瓊脂糖濃度(<1%)的凝膠中定量地轉(zhuǎn)移出來(lái)。轉(zhuǎn)移后得到的雜交信號(hào)比Southern轉(zhuǎn)移強(qiáng)2-3倍。缺點(diǎn)是如不小心，會(huì)使凝膠碎裂, 并且在洗膜不嚴(yán)格時(shí),其背景比毛細(xì)轉(zhuǎn)移要高。
1、材料： 待檢測(cè)的DNA，已標(biāo)記好的探針。
2、設(shè)備： 電泳儀，電泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自顯影盒，X-光片，雜交袋，硝酸纖維素濾膜或尼龍膜，濾紙。
3、試劑：
(1)10mg/ml 溴化乙錠（EB）。
(2)50×Denhardt's溶液：5g Ficoll-40, 5g PVP, 5g BSA加水至500ml,過(guò)濾除菌后于-20℃儲(chǔ)存。
(3)1×BLOTTO:5g脫脂奶粉，0.02%疊氮鈉，儲(chǔ)于4℃。
(4)預(yù)雜交溶液:6×SSC, 5×Denhardt, 0.5% SDS, 100mg/ml鮭魚精子DNA, 50%甲酰胺。
(5)雜交溶液:預(yù)雜交溶液中加入變性探針即為雜交溶液。
(6)0.2mol/L HCl。
(7)0.1% SDS。
(8)0.4mol/L NaOH。
(9)變性溶液:87.75g NaCl, 20.0g NaOH加水至1000ml。
(10)中和溶液:175.5g NaCl, 6.7g Tris·Cl, 加水至1000ml。
(11)硝酸纖維素濾膜。
(12)20×SSC: 3mol/L NaCl, 0.3mol/L檸檬酸鈉,用1mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至7.0;
(13)2×、1×、0.5×、0.25×和0.1×SSC:用20×SSC稀釋。
4、操作步驟：
(1) 約50μl體積中酶切10pg-10μg的DNA, 然后在瓊脂糖凝膠中電泳12-24小時(shí)(包括DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物)。
(2) 500ml水中加入25μl 10mg/ml溴化乙錠,將凝膠放置其中染色30分鐘, 然后照相。
(3) 依次用下列溶液處理凝膠,并輕微搖動(dòng): 500ml 0.2mol/L HCl 10分鐘, 傾去溶液(如果限制性片段>10kb, 酸處理時(shí)間為20分鐘)，用水清洗數(shù)次,傾去溶液; 500ml變性溶液兩次,每次15分鐘,傾去溶液; 500ml中和溶液30分鐘。如果使用尼龍膜雜交，本步可以省略。
(4) 戴上手套,在盤中加20×SSC液,將硝酸纖維素濾膜先用無(wú)菌水完全濕透,再用20×SSC浸泡。將硝酸纖維素濾膜一次準(zhǔn)確地蓋在凝膠上,去除氣泡。用浸過(guò)20×SSC液的3濾紙蓋住濾膜,然后加上干的3濾紙和干紙巾,根據(jù)DNA復(fù)雜程度轉(zhuǎn)移2-12小時(shí)。當(dāng)使用尼龍膜雜交時(shí)，該膜用水浸潤(rùn)一次即可，轉(zhuǎn)移時(shí)用0.4mol/L NaOH代替20×SSC。簡(jiǎn)單的印跡轉(zhuǎn)移2-3小時(shí),對(duì)于基因組印跡,一般需要較長(zhǎng)時(shí)間的轉(zhuǎn)移。
(5) 去除紙巾等,用藍(lán)色圓珠筆在濾膜右上角記下轉(zhuǎn)移日期,做好記號(hào),取出濾膜,在2×SSC中洗5分鐘,涼干后在80℃中烘烤2小時(shí)。注意在使用尼龍膜雜交時(shí)，只能空氣干燥，不得烘烤。
(6) 將濾膜放入含6-10ml預(yù)雜交液的密封小塑料袋中,將預(yù)雜交液加在袋的底部,前后擠壓小袋,使濾膜濕透。在一定溫度下(一般為37-42℃)預(yù)雜交3-12小時(shí)，棄去預(yù)雜交液。
(7) 制備同位素標(biāo)記探針（參見第一節(jié)），探針煮沸變性5分鐘。
(8) 在雜交液中加入探針,混勻。如步驟（6）將混合液注入密封塑料袋中,在與預(yù)雜交相同溫度下雜交6-12小時(shí)。
(9) 取出濾膜,依次用下列溶液處理,并輕輕搖動(dòng): 在室溫下, 1×SSC/0.1% SDS, 15分鐘, 兩次。 在雜交溫度下, 0.25×SSC/0.1% SDS, 15分鐘, 兩次。
(10) 空氣干燥硝酸纖維素濾膜,然后在X光片上曝光。通常曝光1-2天后可見DNA譜帶。對(duì)于≥108 cpm/μg從缺口平移所得探針,可很容易地從10μg哺乳DNA中檢測(cè)到10pg的單拷貝基因。
(1) 酶切DNA, 凝膠電泳分離各酶切片段,然后使DNA原位變性。
(2) 將DNA片段轉(zhuǎn)移到固體支持物(硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)上。
(3) 預(yù)雜交濾膜,掩蓋濾膜上非特異性位點(diǎn)。
(4) 讓探針與同源DNA片段雜交,然后漂洗除去非特異性結(jié)合的探針。
(5) 通過(guò)顯影檢查目的DNA所在的位置。
Southern雜交能否檢出雜交信號(hào)取決于很多因素,包括目的DNA在總DNA中所占的比例、探針的大小和比活性、轉(zhuǎn)移到濾膜上的DNA量以及探針與目的DNA間的配對(duì)情況等。在最佳條件下,放射自顯影曝光數(shù)天后, Southern雜交能很靈敏地檢測(cè)出低于0.1pg與32 P標(biāo)記的高比活性探針的(>109 cpm/μg)互補(bǔ)DNA。如果將10μg基因組DNA轉(zhuǎn)移到濾膜上，并與長(zhǎng)度為幾百個(gè)核苷酸的探針雜交,曝光過(guò)夜,則可檢測(cè)出哺乳動(dòng)物基因組中1kb大小的單拷貝序列。
將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)移到固體支持物上的方法主要有3種:(1)毛細(xì)管轉(zhuǎn)移。本方法由Southern發(fā)明,故又稱為Southern轉(zhuǎn)移(或印跡)。毛細(xì)管轉(zhuǎn)移方法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單,不需要用其他儀器。缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)移時(shí)間較長(zhǎng),轉(zhuǎn)移后雜交信號(hào)較弱。(2)電泳轉(zhuǎn)移。將DNA變性后,可電泳轉(zhuǎn)移至帶電荷的尼龍膜上。該法的優(yōu)點(diǎn)是不需要脫嘌呤/水解作用,可直接轉(zhuǎn)移較大的DNA片段。缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)移中電流較大,溫度難以控制。通常只有當(dāng)毛細(xì)管轉(zhuǎn)移和真空轉(zhuǎn)移無(wú)效時(shí),才采用電泳轉(zhuǎn)移。(3) 真空轉(zhuǎn)移。有多種真空轉(zhuǎn)移的商品化儀器,它們一般是將硝酸纖維素膜或尼龍膜放在真空室上面的多孔屏上,再將凝膠置于濾膜上,緩沖液從上面的一個(gè)貯液槽中流下,洗脫出凝膠中的DNA,使其沉積在濾膜上。該法的優(yōu)點(diǎn)是快速,在30分鐘內(nèi)就能從正常厚度(4-5mm)和正常瓊脂糖濃度(<1%)的凝膠中定量地轉(zhuǎn)移出來(lái)。轉(zhuǎn)移后得到的雜交信號(hào)比Southern轉(zhuǎn)移強(qiáng)2-3倍。缺點(diǎn)是如不小心，會(huì)使凝膠碎裂, 并且在洗膜不嚴(yán)格時(shí),其背景比毛細(xì)轉(zhuǎn)移要高。
1、材料： 待檢測(cè)的DNA，已標(biāo)記好的探針。
2、設(shè)備： 電泳儀，電泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自顯影盒，X-光片，雜交袋，硝酸纖維素濾膜或尼龍膜，濾紙。
3、試劑：
(1)10mg/ml 溴化乙錠（EB）。
(2)50×Denhardt's溶液：5g Ficoll-40, 5g PVP, 5g BSA加水至500ml,過(guò)濾除菌后于-20℃儲(chǔ)存。
(3)1×BLOTTO:5g脫脂奶粉，0.02%疊氮鈉，儲(chǔ)于4℃。
(4)預(yù)雜交溶液:6×SSC, 5×Denhardt, 0.5% SDS, 100mg/ml鮭魚精子DNA, 50%甲酰胺。
(5)雜交溶液:預(yù)雜交溶液中加入變性探針即為雜交溶液。
(6)0.2mol/L HCl。
(7)0.1% SDS。
(8)0.4mol/L NaOH。
(9)變性溶液:87.75g NaCl, 20.0g NaOH加水至1000ml。
(10)中和溶液:175.5g NaCl, 6.7g Tris·Cl, 加水至1000ml。
(11)硝酸纖維素濾膜。
(12)20×SSC: 3mol/L NaCl, 0.3mol/L檸檬酸鈉,用1mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至7.0;
(13)2×、1×、0.5×、0.25×和0.1×SSC:用20×SSC稀釋。
4、操作步驟：
(1) 約50μl體積中酶切10pg-10μg的DNA, 然后在瓊脂糖凝膠中電泳12-24小時(shí)(包括DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物)。
(2) 500ml水中加入25μl 10mg/ml溴化乙錠,將凝膠放置其中染色30分鐘, 然后照相。
(3) 依次用下列溶液處理凝膠,并輕微搖動(dòng): 500ml 0.2mol/L HCl 10分鐘, 傾去溶液(如果限制性片段>10kb, 酸處理時(shí)間為20分鐘)，用水清洗數(shù)次,傾去溶液; 500ml變性溶液兩次,每次15分鐘,傾去溶液; 500ml中和溶液30分鐘。如果使用尼龍膜雜交，本步可以省略。
(4) 戴上手套,在盤中加20×SSC液,將硝酸纖維素濾膜先用無(wú)菌水完全濕透,再用20×SSC浸泡。將硝酸纖維素濾膜一次準(zhǔn)確地蓋在凝膠上,去除氣泡。用浸過(guò)20×SSC液的3濾紙蓋住濾膜,然后加上干的3濾紙和干紙巾,根據(jù)DNA復(fù)雜程度轉(zhuǎn)移2-12小時(shí)。當(dāng)使用尼龍膜雜交時(shí)，該膜用水浸潤(rùn)一次即可，轉(zhuǎn)移時(shí)用0.4mol/L NaOH代替20×SSC。簡(jiǎn)單的印跡轉(zhuǎn)移2-3小時(shí),對(duì)于基因組印跡,一般需要較長(zhǎng)時(shí)間的轉(zhuǎn)移。
(5) 去除紙巾等,用藍(lán)色圓珠筆在濾膜右上角記下轉(zhuǎn)移日期,做好記號(hào),取出濾膜,在2×SSC中洗5分鐘,涼干后在80℃中烘烤2小時(shí)。注意在使用尼龍膜雜交時(shí)，只能空氣干燥，不得烘烤。
(6) 將濾膜放入含6-10ml預(yù)雜交液的密封小塑料袋中,將預(yù)雜交液加在袋的底部,前后擠壓小袋,使濾膜濕透。在一定溫度下(一般為37-42℃)預(yù)雜交3-12小時(shí)，棄去預(yù)雜交液。
(7) 制備同位素標(biāo)記探針（參見第一節(jié)），探針煮沸變性5分鐘。
(8) 在雜交液中加入探針,混勻。如步驟（6）將混合液注入密封塑料袋中,在與預(yù)雜交相同溫度下雜交6-12小時(shí)。
(9) 取出濾膜,依次用下列溶液處理,并輕輕搖動(dòng): 在室溫下, 1×SSC/0.1% SDS, 15分鐘, 兩次。 在雜交溫度下, 0.25×SSC/0.1% SDS, 15分鐘, 兩次。
(10) 空氣干燥硝酸纖維素濾膜,然后在X光片上曝光。通常曝光1-2天后可見DNA譜帶。對(duì)于≥108 cpm/μg從缺口平移所得探針,可很容易地從10μg哺乳DNA中檢測(cè)到10pg的單拷貝基因。
