�。�1）細(xì)胞核的分離：將培養(yǎng)的細(xì)胞制成細(xì)胞混懸液，或以胰蛋白酶消化法于培養(yǎng)蓋上收集培養(yǎng)細(xì)胞。應(yīng)用MgSO4染色分離方法分離細(xì)胞核（Van den Engh et al 1986, 在Traok和Van Den Engh 34章 ）。細(xì)胞混懸液濃度為5×106/ml。利用RNA酶消化后，使核從細(xì)胞分離，細(xì)胞核混懸液濃度為4～5×106細(xì)胞核/ml。
�。�2）細(xì)胞固定和酸的處理：在5ml試管內(nèi)加冷的100%酒精不斷旋轉(zhuǎn)以達(dá)到滿意的固定。在冰上停留10min。在4℃離心（×150g）10min。重復(fù)加三次冷的100%酒精入試管內(nèi)，離心，傾去。置于冰上10min，再離心。然后加入相當(dāng)核懸液1/2量的0.1n HCl , 0.5% Triton X-100。室溫停留10min。加入IBM-0.25%Triton X-100（IBM配方：50mmol/l KCl, 10mmol/L MgSO4, 5mmol/L HEPES pH8.0）。再離心，重復(fù)IBM漂洗（這時(shí)細(xì)胞核可在不染色情況下，以熒光顯微鏡觀察）后，以2×SSC-0.1%Tween漂洗1×3min，繼之加入等量2%的多聚甲醛在1×PBS-5mmol/l MgSO4。在室溫靜置站立10min。傾去上清液，加IBm -Triton X-100漂洗，離心，使細(xì)胞核混懸液最終濃度為108/ml，（可用IBM-Triton X-100稀釋約50倍，在血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)），混懸液鏡檢應(yīng)含單個(gè)，完整的細(xì)胞核。
�。�3）細(xì)胞核混懸液雜交
①配制雜交混合液：甲酰胺5份，20×SSC1份，50%硫酸葡聚糖2份，pH調(diào)至7.0。此原液（stock solution）可貯存在4℃冰箱內(nèi)。應(yīng)用時(shí)加1份10mg/ml鯡魚精子DNA（herring sperm DNA）。
�、诨旌�1μl的細(xì)胞核混懸液（108/ml）與18μl的雜交混合液，充分混勻。將此19μl混合液移入1.5ml容積的Eppendorf 管中（核含量約為105）。
③加入100ng/每管的AAF標(biāo)記DNA探針（如為生物素標(biāo)記DNA探針濃度為20～40ng/每管）。
�、苤�70℃10min使DNA探針和核DNA變性。
�、莺徒M織切片與DNA探針雜交方法相較，不同的是在加熱變性后切勿置冰上迅速冷卻以終止反應(yīng)，而應(yīng)迅速轉(zhuǎn)入37℃孵育過(guò)夜。
（4）雜交后漂洗
�、僭诿抗苤屑尤�1.25ml 50%甲酰胺-2×SSC（pH7.0），在42℃靜置10～15min。偶爾旋轉(zhuǎn)以助混勻。冷卻至室溫。加100μl經(jīng)dimethylsuberimidate(DEMS)處理的血細(xì)胞（107/ml）混勻，離心，室溫，10min，輕彈試管使沉淀的小塊散開，加入1.25ml 2×SSC(pH7.0)，42℃，繼之，靜置于室溫10～15min，如前離心，再加1.25ml IBM-Triton X-100,室溫靜置5min，離心。
注：DEMS處理紅細(xì)胞方法：經(jīng)漂洗并離心去除白細(xì)胞和血清的紅細(xì)胞在鹽液如PBS中，細(xì)胞含量為108/ml，以K2CO3和DEMS溶液處理3次，第1次：K2CO3為20mmol/L,DEMS為3mmol/L，以后2次：K2CO3依然為20mmol/L，而DEMS為10mmol/L。在應(yīng)用前將K2CO3和DEMS液混合加入紅細(xì)胞混懸液中。在最后2次漂洗液中，應(yīng)用100mmol/l K2CO3將pH調(diào)至9～10。在25℃，15min后，加入50μl，100mmol/l 的檸檬酸（citric acid）/每ml細(xì)胞混懸液的濃度以達(dá)固定紅細(xì)胞的目的。固定的紅細(xì)胞離心傾去上清液后，用2×SSC稀釋到108/ml，加0.1%疊氮鈉可在4℃保存至少1年。
�。�5）AFF標(biāo)記的熒光顯示：加200μl的PBS含0.05%Tween和2%正常血清（NGS），輕輕振蕩混勻，室溫靜置10min，加20μl 1：100的單克隆抗AFF抗體，37℃孵育45min，加1.25ml的PBS-Tween，室溫靜置10min，加20間歇性振蕩，離心，傾去上清液，加200μlPBS含0.05%Tween –2%NGS,振蕩，室溫靜置10min，加20μl的羊抗小鼠–FITC熒光標(biāo)記抗血清，稀釋度1：100～1：300。孵育于37℃45min，加1.25ml PBS –Tween,室溫靜置10min，離心，傾去上清液。
�。�6）生物素標(biāo)記探針的熒光顯示：加200μl 4×SSC含0.1%Trion X-100 和5%BSA。室溫靜置10min后，加20μl抗生物素標(biāo)記FITC抗血清15μg/ml，孵育在37℃30min，以1.5ml 4×SSc –0.1% Trion X-100洗1次，加入1.25ml IBm –Triton X-100,室溫靜置10～15min，間歇振蕩、離心。
�。�7）熒光顯微鏡觀察：將細(xì)胞核混懸液稀釋于250μl的IBM-Trion X-100中，輕加振蕩混勻。為抗熒光褪色可加等量的抗褪色溶液至載片上的細(xì)胞核涂片上，選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長(zhǎng)觀察。
�。�8）流式細(xì)胞計(jì)：將750μl的細(xì)胞核混懸液通過(guò)流式細(xì)胞儀（Flow cytometry, FCM），DEMS處理過(guò)的紅細(xì)胞作為對(duì)照（Df 530/30nm, Omega ·Optical Inc, Brattleboro, VT）。
