1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增
1.1制備XL1-Blue感受態(tài)細(xì)菌
1． 取400uL XL1-Blue菌種加入到含200ml LB培養(yǎng)基的錐形瓶中，37 ℃、100rpm培養(yǎng)4h，離心，倒置，以冰冷的0.1 mol／L CaCl_2重懸細(xì)菌，冰浴30 min，離心，棄上清，倒置，再加4ml(含15％甘油)冰冷的CaCl2重懸細(xì)菌，分裝(200 μ／tube)，-80 ℃保存。
2． 轉(zhuǎn)化：在冰浴中將1管XL1-Blue感受態(tài)菌解凍，將濃度為2ng／μ1的質(zhì)粒DNA4μ1加入到8Oμ1感受態(tài)菌中。
3． 輕輕搖勻，冰浴30 min。
4．42 ℃熱激9O秒，然后迅速冰浴2 min。
5． 加入LB培養(yǎng)液(無氨芐青霉素)0.8ml，在37 ℃，100轉(zhuǎn)／min水浴孵育60 min。
6．取200μl菌液鋪于瓊脂板上(涂有X-Gal(20mg／ml)-IPTG(200mg／ml)的 LB-氨芐青霉素50 mg／ml,1μl／ml培養(yǎng)基)，待菌液全部被吸收后，倒置平板于37 ℃培養(yǎng)12-16h。
1.2鑒定和挑選含重組質(zhì)粒的菌落
1． 用無菌牙簽挑取單菌落，接種到10 ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液的離心管中，于37 ℃，200轉(zhuǎn)／分培養(yǎng)2h，取1 ml之一Eppendorf離心管，加50μl10mmol／L EDTA(pH 8.0)。
2． 加入50μl新配置的0.2mol／L NaOH、0.5％SDS、20％蔗糖溶液后，振蕩3O秒。
3． 在70 ℃溫育5 min，然后冷卻到室溫。
4． 加1.5μ14mol／L KCl和0.5μ1含0.4％溴酚蘭染液，振蕩3O秒后，冰浴5min。
5． 12000g，4 ℃離以 3 min，以除去細(xì)菌碎片。
6． 制備1％的瓊脂糖凝膠(含EB0.5μg／ml)，取50μl上清液加入到樣品孔中，其中一孔加入中等分子量DNA Marker。恒壓50V，進(jìn)行電泳。
7． 當(dāng)溴酚蘭遷移到凝膠全長的2／3-3／4時(shí)，停止電泳，在紫外燈下檢查質(zhì)粒DNA分于量的大小是否與轉(zhuǎn)入質(zhì)粒相符。
1.3質(zhì)粒的擴(kuò)增和純化
1． 用無菌牙簽分別挑取單個(gè)白色菌落移入含30ml LB-氨芐青霉素(50μg／ml)培養(yǎng)液的聚丙烯管中，于37 ℃，200轉(zhuǎn)／分培養(yǎng)3h。
2． 將菌液轉(zhuǎn)入含70 ml LB-氨芐青霉素培養(yǎng)液的250ml錐形瓶中，37 ℃，200轉(zhuǎn)／分培養(yǎng)過夜(12-16h)，細(xì)菌渾濁。
3. 菌液中加入氯霉素液(34mg溶于lml乙醇，100ml菌液加入0.5ml氯霉素溶液，終濃度為170 μ／ml)。37 ℃，200轉(zhuǎn)／分培養(yǎng)12-16h。
4. 將培養(yǎng)的細(xì)菌倒入50ml的離心管中，6000rpm，4 ℃離,th,15 min，沉淀細(xì)菌。
5. 棄凈上清夜，用2ml預(yù)冷的溶液I，懸浮菌體沉淀，劇烈振蕩，于室溫靜置5 min
6. 加入新配制的溶液II 4ml，快速用手晃動(dòng)10秒，顛倒數(shù)次后，于室溫靜置10 min。
7. 加入預(yù)冷的溶液III 3ml，溫和振蕩l0秒，于冰上靜置10 min，出現(xiàn)白色絮狀沉淀。
8． 6000rpm，4 ℃離心15 min，保留上清。
9． 將上清(若帶細(xì)菌殘片，則再次離心)移入另一50ml的離心管中，加入O.6倍體積的異丙醇混勻，于室溫靜置10 min。(或-20 ℃4h，或4 ℃過夜，可便核酸沉淀)
10.12000 rpm，4 ℃離心15 min，回收核酸。小心棄去上清，倒置離心管使殘兼上清液流盡。
11．于室溫用70％的乙醇洗滌沉淀物和管壁，室溫12000 rpm離心，15 min，充分棄去乙醇，于室溫將離心管倒置在紙巾上，使最后殘余的痕量乙醇揮發(fā)殆盡。
12．用500μl TE(pH8.0)溶解核酸沉淀，轉(zhuǎn)移至1.5 ml Eppendorf管中。
13．加入用冰預(yù)冷的5mol／L的LiCl溶液600μl，充分混勻。12000 rpm，4 ℃離心15 min，以沉淀高分子量的RNA。
14.將上清轉(zhuǎn)移到另一1.5 ml Eppendorf管中，加等量異丙醇，充分混勻，于室溫靜置10min。
15.12000 rpm,4 ℃離心15 min，回收核酸。小心棄去上清，倒置離心管使殘余上清液流盡。
16．于室溫用70％的乙醇洗滌沉淀物和管壁，室溫12000 rpm離心，15 min，充分棄去乙醇，于室溫將離心管倒置在紙巾上，使最后殘余的痕量乙醇揮發(fā)殆盡。
17.400μl含無DNA酶的RNA酶(20μg/ml)的TE緩沖液(pH8.0)溶解沉淀，將溶液轉(zhuǎn)移到另－1.5 ml Eppendorf管中，室溫放置1.5ml Eppendorf管中30min。
18．加入400μl 13％(v／v)的PEG 8000-NaCl(1.6 mol／L)，混勻，4 ℃ 12000rpm離心5 min以回收質(zhì)粒DNA，棄去上清。
19．加入400μl TE緩沖液(pH 8.O)溶解沉淀，再分別用等體積的Tris飽和酚、酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)、和氯仿各抽提一次。
20．將水相(上清)移入另一1.5ml Eppendorf管中，加入O.1體積(約50μ13M的醋酸鈉(pH 5.2)和2倍體積(大約1 ml)的無水乙醇，充分混勻后于4℃放置30 min。
21．于4 ℃ 12000 rpm離心5 min回收沉淀的質(zhì)粒DNA。盡可能棄去上清，敞開管口，置工作臺(tái)上使殘留的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。
22．加入400 μl處于4 ℃的70％乙醇，稍加振蕩，漂洗沉淀，4 ℃ 12000 rpm離心2 min。
23．吸去上清，室溫敞開管口，直到乙醇完全揮發(fā)。
24．用100μl TE緩沖液(pH 8.0)溶解沉淀。
25．取4μl溶液1：100稀釋后，測(cè)定其OD260、OD280，以確定質(zhì)粒DNA的純度和濃度(OD260／D280>1.8。OD260／OD280對(duì)DNA而言其值大約為1.8，高于2.0則可能有RNA污染，低于1.8則有蛋白質(zhì)污染。；DNA濃度=OD260 X 0.05 X稀釋倍數(shù)(μg／μl)。
26．質(zhì)粒DNA溶液于-20 ℃保存待用。
二、cRNA探針的標(biāo)記
1． 將質(zhì)粒DNA，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶線性化，通過瓊脂糖凝膠電泳以確保完全線性化。
2． 線性化后的DNA按“質(zhì)粒的純化”步驟19-24進(jìn)行純化，作為cRNA探針標(biāo)記的模板，用相應(yīng)的RNA聚合酶合成地高辛標(biāo)記的反義和正義RNA探針。
3． 進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，步驟如下：
4． 在冰上將各試劑加入一1.5 ml無RNA酶的Eppendorf管中。
DEPC處理的三蒸水8μl
質(zhì)粒DNA模板 0.05μg／μl 1μl
10 x NTP地高辛標(biāo)記混合物 1 x 2μl
0.1 M DTT溶液 10 mM 2μl
5 x轉(zhuǎn)錄緩沖液 1 x 4μl
RNAse抑制劑 2U／μl 1μl
RNA聚合酶 2U/μl 2μl
反應(yīng)體系總體積 20μl
5． 加入上述各試劑后，混勻，簡短離心后在37 ℃孵育2h。
6． 加入2μl無RNA酶的DNA酶I(10U／μ1)，37 ℃孵育15 min降解模板DNA。
7． 加入0.2M EDTA(pH 8.0)溶液2μl終止反應(yīng)。
8． 加入2.5μl的4 M Licl和7.5μl冷的無水乙醇，混勻，-20 ℃放置2h。
9． 12000g下離以 15 min，棄上清，小心地用50 μl冷的70％乙醇洗滌沉淀。
1O．室溫下稍干燥，溶于100μ1 DEPC處理過的三蒸水中，混勻分裝，-20 ℃下保持備用。
三、原位雜交
3.1冰凍切片與雜交前預(yù)處理
1． 將子宮樣品從-80 ℃取出，用OCT包埋，在-23 ℃(切片機(jī)腔體溫度)平衡至少30 min。將包埋好的樣品固定在樣品頭上，切10μm厚的連續(xù)組織切片，平鋪于涂有多聚賴氨酸(1mg／m1)的玻片上(玻片預(yù)先經(jīng)180 ℃干烤6小時(shí))，保存于-70 ℃冰柜備用。
2． 冰凍切片經(jīng)室溫干燥10 min后，在4％的多聚甲醛-PBS(pH 7.4)固定lOmin。
3． 活躍的DEPC-PBS(未高壓的0.1％DEPC-1XPBS溶液)洗2次，每次5 min。
4． 在0.2M的鹽酸作用中作用10 min后，重復(fù)步驟4)。
5． 在切片上滴加蛋白酶K(0.1μg／m1)，37 ℃孵育15 min，重復(fù)步驟4)。
6． 經(jīng)0.1M TEA(三乙醇胺)作用5min后，再在新配制的0.25％AA／0.1M TEA (乙酸酐／三乙醇胺，pH 8.0)中乙�；�10 min。
(在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中，步驟4，5，6省略)
7． 5 x SSC中平衡15 min。
3.2雜交
8． 在脫水后的玻片上滴加預(yù)雜交液(約100 μl／玻片)，置于放有濕盒液(50％甲酰胺v／v；0.3 M NaCl；1Mm EDTA；10 mM Tris-Cl，pH 8.O)的濕盒中，55～58 ℃下的烘箱中預(yù)雜交2 h。
9． 甩掉預(yù)雜交液，地高辛標(biāo)記的反義或正義cRNA探針(濃度1-2ng／μl)經(jīng)70 ℃變性1O分鐘，置冰上1 min，玻片上滴加預(yù)雜交液(約60μl／玻片)，覆蓋parafilm膜，放濕盒中在48～58 ℃下雜交18-30 h。
3.3雜交后處理
1O．取出玻片，小心去掉Parafilm膜，甩掉雜交液，用52 ℃預(yù)熱的5×SSC洗30 min。
11．在無DNA的RNA酶A(20μg／ml)溶液中37 ℃下孵育30 min。
12．分別依次用52 ℃預(yù)熱的2 X SSC，1 X SSC和O.1 X SSC洗2次，每次30 min。
3.4雜交信號(hào)檢測(cè)
13．在緩沖液A(0.1M Tris-HC 1 pH 7.5，0.15M NaC1)中平衡5min。
14．在玻片上滴加堿性磷酸酶的抗地高辛抗體(1：500～1:2000稀釋于含0.5％阻斷液的緩沖液A中)，室溫反應(yīng)2h。
15．用緩沖液A洗2次，每次15 min。
16．在緩沖液B(0.1M Tris-HCl；0.1M NaCl；0.05M MgCl_2，pH 9.5)中平衡5min。
17．硝基四氮唑藍(lán)(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚氧磷酸鹽(BCIP)溶于緩沖液B中，每ml緩沖液B含有4.5μ1 NBT和3.5μ1 BCIP。在玻片上滴加混合染液在濕盒中顯色過夜。
18．充分顯色后，用EDTA(1 mM EDTA，pH 8.0)洗15 min終止反應(yīng)。
19．在95％乙醇中洗l h以除去非特異的背景。
20．用蒸餾水洗15 min除去可能存在的結(jié)晶體。
21．脫水、透明，用中性樹膠封片。
22．充分干燥后在顯微鏡下觀察、照相。
