單拷貝克隆產(chǎn)量低，高拷貝克隆穩(wěn)定性差，一直讓研究者在克隆表達時難以選擇。蛋白的表達就有誘導(dǎo)表達系統(tǒng)，可以實現(xiàn)人為地控制蛋白的表達時間和表達量——現(xiàn)在連質(zhì)粒的拷貝數(shù)可以借助誘導(dǎo)的方法來人為控制了！Epicentre的專利技術(shù)——CopyControl克隆系統(tǒng)能夠讓您共享單拷貝和高拷貝的優(yōu)點。CopyControl克隆首先以單拷貝形式生長——單拷貝可以確保插入穩(wěn)定及成功克隆編碼毒性基因序列——在需要的時候，再誘導(dǎo)成高拷貝克隆，以便下游應(yīng)用所需。這一系統(tǒng)可以用來構(gòu)建PCR克隆，對于BAC，fosmid文庫等大型質(zhì)粒格外有用。
CopyControl克隆系統(tǒng)有兩個重要的成分：
1．CopyControl pCC1 Vector.
這個載體含有兩個復(fù)制起始位點：單拷貝的大腸桿菌F-因子復(fù)制子，和誘導(dǎo)型的高拷貝oriV。 OriV的啟動，需要trfA基因產(chǎn)物，trfA基因既不在pCC1 Vector上，也不在其他常規(guī)用來克隆的大腸桿菌菌株中，這個基因由CopyControl 的第二個重要元件—— TransforMax EPI300 E.coli菌株提供。
2．TransforMax EPI300 E.coli.
這是一個工程菌株，含有受誘導(dǎo)啟動子嚴謹控制的trf A基因，在誘導(dǎo)表達的條件下可以提供啟動oriV所需要的trf A基因產(chǎn)物。另外phage T1-resistant TransforMax EPI300-T1R E.Coli也可提供這個基因的產(chǎn)物。
CopyControl克隆和克隆誘導(dǎo)步驟：
1、將目標DNA片斷連接到已經(jīng)線性化、去磷酸化的CopyControl pCC1 Vector上。
2、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞（TransforMax EPI300 E.coli），涂皿，在氯霉素LB培養(yǎng)基上篩選。在這種條件下，trfA基因的表達被抑制，克隆以單拷貝數(shù)量生長。
3、挑選克隆，單個培養(yǎng)。
4、加CopyControl誘導(dǎo)溶液到管中。誘導(dǎo)溶液誘導(dǎo)TransforMax EPI300 宿主細胞內(nèi)trfA基因的表達，從而啟動oriV，克隆由單拷貝轉(zhuǎn)化為高拷貝。
5、用常規(guī)方法從誘導(dǎo)細胞內(nèi)分離DNA。
這個系統(tǒng)用于常規(guī)PCR克隆或者文庫構(gòu)建時，經(jīng)過誘導(dǎo)，每個細胞中的質(zhì)�？截悢�(shù)可以從1個提高到200個，非常厲害，對于下游的表達或者核酸純化、測序等都很有幫助。而對于BAC和Fosmid等低拷貝的大型質(zhì)粒來說，單拷貝的克隆的穩(wěn)定性是非常重要的考慮因素，經(jīng)過誘導(dǎo)后每個細胞中質(zhì)粒的拷貝數(shù)可以達到10—50個，對于后繼的實驗更有重要的意義。
