實(shí)時(shí)定量PCR已廣泛地運(yùn)用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，就目前的應(yīng)用情況來看，雖然取得了很好的效果，但是其在方法學(xué)上的選擇、敏感性問題、重復(fù)性問題等都一直是爭論不休的，本文將就這些問題做出探討。
1. 方法的選擇：研究者在實(shí)驗(yàn)中往往想要得到目的基因的絕對(duì)量，因?yàn)榻^對(duì)定量對(duì)目的基因的表達(dá)差異有直接的反映[38]。絕對(duì)定量最為簡單的方法就是標(biāo)準(zhǔn)曲線法，用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在同等條件下目的基因測(cè)得的熒光信號(hào)量同標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，從而得到目的基因的量。該標(biāo)準(zhǔn)品可以是純化的質(zhì)粒dsDNA，體外轉(zhuǎn)錄的RNA，或者是體外合成的ssDNA[39]。目的基因與標(biāo)準(zhǔn)品在不同的反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，使用的熒光材料可以是雜交探針、水解探針或是SYBR Green I。有研究表明[40]，這一方法的動(dòng)力學(xué)范圍可以達(dá)到9個(gè)數(shù)量級(jí)，遠(yuǎn)比終點(diǎn)法的要高。這一方法雖然簡便，但是為了得到可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，有兩個(gè)先決條件必須等到滿足，一是所選用的標(biāo)準(zhǔn)品必須與目的基因的擴(kuò)增效率一致，要達(dá)到這個(gè)要求，需要標(biāo)準(zhǔn)品同目的基因的同源性盡可能的高，不僅長度相似，而且其堿基組成也盡量相同；二是要盡可能地優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件和模板的準(zhǔn)備過程。就標(biāo)準(zhǔn)品而言，實(shí)踐中有外參照和內(nèi)參照之分，作為外參照的標(biāo)準(zhǔn)品與目的基因不在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，所以它無法檢測(cè)也不可能補(bǔ)償可能出現(xiàn)在目的基因反應(yīng)體系中的影響因素，如PCR抑制子[41]。事實(shí)上，在絕大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)中，要想使標(biāo)準(zhǔn)品和目的基因的擴(kuò)增效率完全一致是不可能的。為了彌補(bǔ)單獨(dú)使用一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品作為外參照的不足，研究者便引入一個(gè)內(nèi)參照同目的基因在同一反應(yīng)體系中同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，以反映體系中可能出現(xiàn)的PCR影響因素，此即所謂的競爭性PCR。競爭性PCR 所使用的內(nèi)參照具有與目的基因序列相同的引物結(jié)合位點(diǎn)，但不具有相同的探針結(jié)合位點(diǎn)[42]。關(guān)于內(nèi)參照的設(shè)計(jì)，有多種方法可供選擇，例如向目的基因序列中引入插入或缺失突變[43]，改變目的基因中的某些核苷酸[44]，設(shè)計(jì)不同的限制性酶識(shí)別位點(diǎn)[45]，也可以用非特異的間隔基因或間隔DNA 作為內(nèi)參照[46]。競爭性PCR 設(shè)計(jì)的原理在于內(nèi)參照與目的基因相互競爭反應(yīng)的原料，所以兩者的量應(yīng)當(dāng)相互匹配，如果一方的拷貝數(shù)大大的高于另一方，那么拷貝數(shù)多的一方就會(huì)在反應(yīng)體系中得到優(yōu)先擴(kuò)增，而拷貝數(shù)少的一方則擴(kuò)增受到抑制，定量也就不能有效地進(jìn)行。由于使用了內(nèi)對(duì)照，所以一旦體系中存在干擾PCR擴(kuò)增的因素，就會(huì)通過內(nèi)對(duì)照的擴(kuò)增效率的變化反映出來，目前使用的實(shí)時(shí)定量PCR儀都是以擴(kuò)增曲線上crossing point的漂移來體現(xiàn)擴(kuò)增效率的變化的。競爭性PCR 由于能夠消除反應(yīng)體系中干擾因素的影響，所以它所等到的結(jié)果要準(zhǔn)確可靠得多，但是由于在反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增兩種模板，使得其結(jié)果的測(cè)定范圍比單使用外參要大為縮小，往往只有2-3個(gè)數(shù)量級(jí)[40]。正是由于競爭性PCR 有利有辟，所以研究者應(yīng)根據(jù)不同的情況決定是否使用內(nèi)參照。
在目前的研究中，大多數(shù)研究者選擇使用絕對(duì)定量的方法，但是也有學(xué)者[47]認(rèn)為在當(dāng)前的條件下，絕對(duì)定量具有難以克服的缺陷，主要包括:(1)制作一系列稀釋濃度的標(biāo)準(zhǔn)品不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且也有相當(dāng)多的問題，目前廣泛使用的在260nm波長下定量的方法與眾多因素有關(guān)，如水、緩沖液、儀器性能，乃至于核酸的抽提過程都會(huì)影響到結(jié)果的穩(wěn)定性。（2）標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定保存很難獲得成功，高濃度的核酸物質(zhì)易于被降解，而每次配制新的標(biāo)準(zhǔn)品又會(huì)增加批間差異。（3）每次測(cè)定樣本都要同時(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品，而熱循環(huán)儀的樣本孔往往有限，所以使得不能在單批內(nèi)測(cè)定更多的樣本，這樣也就使實(shí)時(shí)PCR 的高通量有所降低。（4）由于樣本來源存在極大的差異，所以很難保證標(biāo)準(zhǔn)品與目的基因的擴(kuò)增效率一致。這樣會(huì)大大增加結(jié)果的變異，即使是各樣本的DNA（或cDNA）有極小的差異或模板片斷不均一，都會(huì)對(duì)定量的結(jié)果造成很大的差異。鑒于以上原因，這些學(xué)者強(qiáng)烈地推薦使用相對(duì)定量的方法，所謂相對(duì)定量是指在測(cè)定目的基因的同時(shí)測(cè)定某一內(nèi)源性管家基因，該管家基因的作用有（1）用于核苷酸的拷貝數(shù)的比較；（2）作為內(nèi)源性對(duì)照補(bǔ)償待測(cè)樣本的體積變異、核酸抽提過程中造成的目的基因變異，以及反映反應(yīng)體系內(nèi)是否存在PCR擴(kuò)增的影響因素；（3）標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)本[47]。由于管家基因在各種組織中是恒定表達(dá)的，所以可以以管家基因的定量來作為某種標(biāo)準(zhǔn)以比較樣本來源不同的目的基因表達(dá)量的差異。通常選用的管家基因有GAPDH 、β-actin、β2-微球蛋白和rRNA，研究者也可以根據(jù)具體的需要而選定合適的管家基因。使用的相對(duì)定量較為早期的方法是用一系列已知外參物做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線得到目的基因和管家基因的量，再將目的基因的同管家基因的比值作為定量的最后結(jié)果。這一方法要求外參、目的基因和管家基因的擴(kuò)增效率一致。除了這種常用的方法之外，最近Livak和Schmittgen[48]設(shè)計(jì)了一種比較閾值法來測(cè)定目的基因的相對(duì)表達(dá)，他們根據(jù)數(shù)學(xué)推導(dǎo)得出目的基因的量=2-^^Ct，在該公式中，Ct是熱循環(huán)儀檢測(cè)到反應(yīng)體系中熒光信號(hào)的強(qiáng)度值，ΔΔCt=(Ct,目的基因-Ct,管家基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct,目的基因-Ct,管家基因)對(duì)照，所以，2-^^Ct表示的是實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù)，使用這一方法可以直接得到的目的基因相對(duì)于管家基因的定量，而不必制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，所以這一方法更為簡便省時(shí)。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明這一方法的結(jié)果也是相當(dāng)可靠的。
總之，相對(duì)定量不僅比絕對(duì)定量更加簡單，經(jīng)濟(jì)（如果不做標(biāo)準(zhǔn)曲線），而且也更為可靠和準(zhǔn)確，因?yàn)榇嬖谟诜磻?yīng)體系中的干擾因素，如樣本不純、試劑影響等都可以通過數(shù)學(xué)處理而去除。
2. 重復(fù)性問題：重復(fù)性是判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)劣的重要指標(biāo)，其主要判斷指標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV）。對(duì)于特定的分析系統(tǒng)，重復(fù)性的高低決定了PCR反應(yīng)能檢測(cè)出樣本中目的基因的初始濃度變化的最小值。由于PCR反應(yīng)本身具有不精確擴(kuò)增的特性，它所造成的結(jié)果精確性要遠(yuǎn)小于經(jīng)典的臨床化學(xué)檢驗(yàn)和免疫分析。對(duì)于絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)，一般都可以計(jì)算出所設(shè)計(jì)體系能檢測(cè)出樣本初始濃度的最小值，根據(jù)多次實(shí)驗(yàn)可以求得該最小值的變異情況和它的可信區(qū)間范圍，變異越小或是可信區(qū)間范圍越小，說明這一反應(yīng)體系的精確度越高。在實(shí)時(shí)定量PCR過程中，從樣本的準(zhǔn)備到擴(kuò)增，再到定量的進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)中的每個(gè)方面都與實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性息息相關(guān)，除了加樣的準(zhǔn)確性和實(shí)驗(yàn)所選用的儀器固定參數(shù)的限制之外，影響結(jié)果重復(fù)性較為關(guān)鍵的因素還包括（1）PCR 反應(yīng)擴(kuò)增的效率，如果在反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不一致，就會(huì)影響到目的基因在單位時(shí)間內(nèi)的產(chǎn)量發(fā)生差異，從而影響到結(jié)果的穩(wěn)定，要解決這個(gè)問題，必須盡量優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，使反應(yīng)體系達(dá)到最佳擴(kuò)增效率。（2）目的基因的初始濃度，初始拷貝數(shù)越低，結(jié)果的重復(fù)性越差，為了保證獲得精確的結(jié)果，應(yīng)使用初始濃度具有較高數(shù)量級(jí)的樣本，如果待測(cè)樣本中目的基因的量處于反應(yīng)體系的檢出限附近，那么最好是使用復(fù)孔以保證結(jié)果的可靠性。（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響，對(duì)于必須進(jìn)行絕對(duì)定量的研究，標(biāo)準(zhǔn)曲線是必不可少的，雖然標(biāo)準(zhǔn)品和樣本之間的差異始終存在，但是制作一個(gè)好的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)定量結(jié)果至關(guān)重要，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，應(yīng)至少選擇5個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品，涵蓋待測(cè)樣本中目的基因量可能出現(xiàn)的全部濃度范圍，理想的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)與樣本具有高同源性，最好是選擇純化的質(zhì)粒DNA 或是體外合成、轉(zhuǎn)錄的RNA（用于RT-PCR），在制備過程中，應(yīng)使用規(guī)范的步驟或是根據(jù)所購買的試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)操作手冊(cè)進(jìn)行。
3. 敏感度問題：實(shí)時(shí)定量PCR 由于使用了熒光物質(zhì)作為定量的工具，使得其敏感性又大大地提高了，有人[47]報(bào)導(dǎo)實(shí)時(shí)定量PCR 的敏感性要高出傳統(tǒng)的終點(diǎn)定量PCR 大約250倍。在理論上，只要設(shè)計(jì)的引物對(duì)目的基因有足夠的特異性，PCR 應(yīng)可檢測(cè)出只含一個(gè)拷貝目的基因的樣本，也的確有人報(bào)導(dǎo)在特定的反應(yīng)條件下，實(shí)時(shí)定量PCR 可以檢測(cè)出單細(xì)胞水平的基因組DNA[11]，但是在大多數(shù)情況下，對(duì)基因組DNA而言，它的最低檢出限一般在pg到fg級(jí)，對(duì)于病毒、質(zhì)粒而言，其檢出限一般在102-103拷貝數(shù)以上[8]。影響實(shí)時(shí)定量PCR 敏感性的因素眾多，除了對(duì)一般PCR反應(yīng)均存在的影響因素如反應(yīng)體系、Taq酶的活性之外,實(shí)時(shí)定量PCR還有其特殊的影響因素，包括：
(1)反應(yīng)體系中形成的引物二聚體的影響：引物二聚體是非特異性退火和延伸的產(chǎn)物,它的形成不僅會(huì)影響到擴(kuò)增的效率,而且由于SYBR Green I可以與所有的雙鏈DNA結(jié)合,所以會(huì)在反應(yīng)體系中出現(xiàn)特異性產(chǎn)物與引物二聚體競爭SYBR Green I的現(xiàn)象,從而降低了實(shí)時(shí)PCR的敏感性。要解決這個(gè)問題，有多種方案可供選擇，首先可以用水解探針代替SYBR Green I，雖然水解探針并不能消除引物二聚體的形成，但是在定量檢測(cè)時(shí)，它卻可以避開引物二聚體的干擾，專一地測(cè)定來自于特異產(chǎn)物的熒光信號(hào)，有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)使用水解探針的敏感性要比SYBR Green I高出10倍。其次，可以使用熱啟動(dòng)辦法，所謂熱啟動(dòng)是指在反應(yīng)體系達(dá)到引物退火溫度時(shí)才加入某一反應(yīng)成分，因?yàn)橐锒垠w的是在各種試劑一經(jīng)混合便開始形成的，所以用這種方法能有效地減少引物二聚體的形成，另外Lightcycler提供一種Taq酶的抗體，在PCR反應(yīng)的最初階段，這種抗體能阻斷Taq酶的作用，但是當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到70度時(shí)，它便失活，使Taq酶開始發(fā)揮作用，在反應(yīng)體系中加入這一抗體的目的也就是使要在反應(yīng)達(dá)到較高溫度時(shí)，才開始PCR擴(kuò)增，從而避免反應(yīng)初始階段引物二聚體的形成。第三，要盡可能地優(yōu)化引物設(shè)計(jì)，例如所設(shè)計(jì)的兩條引物不能互補(bǔ)（尤其在3’端），使兩條引物的GC含量大致一致，使用純化的引物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)等，這些都是防止引物二聚體形成的根本因素。第四，如果反應(yīng)體系中出現(xiàn)PCR的抑制因素，應(yīng)適當(dāng)將目的基因的濃度稀釋后再進(jìn)行擴(kuò)增。最后，在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)當(dāng)注意避免室溫混合各種試劑，并且在一經(jīng)混合后立即開始進(jìn)行擴(kuò)增。
（2）循環(huán)數(shù)：一般的實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)只須25－30個(gè)循環(huán)便可獲得滿意的結(jié)果，但是對(duì)于那些極微量的待測(cè)樣本而言，適當(dāng)增加循環(huán)數(shù)可以提高反應(yīng)的檢出限，有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)當(dāng)循環(huán)數(shù)從25增加到34個(gè)循環(huán)時(shí)，實(shí)時(shí)定量PCR的最低檢出限可從106增加到103。但是并非循環(huán)數(shù)增加得越多，其敏感性就會(huì)越高，實(shí)際上，當(dāng)循環(huán)數(shù)增加到某一值時(shí)，敏感性便不再升高，因?yàn)檠h(huán)數(shù)并不是影響敏感性的唯一因素，而且在實(shí)驗(yàn)過程中，也不可能因?yàn)樵黾用舾行远鵁o限制地增加循環(huán)數(shù)，這不僅是實(shí)踐中行不通，而且在理論上也不可行，因?yàn)殡S著循環(huán)數(shù)的增加，一方面，聚積的產(chǎn)物會(huì)抑制Taq酶的活性，另一方面，也會(huì)增加形成異源二聚體的可能性，這些都會(huì)影響到最終的定量結(jié)果。
（3）Mg2＋的濃度：根據(jù)Roche公司的Lightcycler3.5版本技術(shù)說明，Mg2 的濃度將影響到實(shí)時(shí)定量PCR的敏感性，其推薦使用的濃度為3mM。Mg2 濃度對(duì)敏感性的影響主要存在于兩方面，首先，Mg2 是影響Taq酶活性的關(guān)鍵因素，如果Mg2 的濃度無法達(dá)到使Taq酶發(fā)揮最佳活性，無疑將會(huì)影響到實(shí)時(shí)定量的敏感性；其次，Mg2 的濃度過高，會(huì)增加引物二聚體的形成，從而導(dǎo)致敏感性降低。所以在反應(yīng)中選擇合適的Mg2 濃度條件，是相當(dāng)重要的。
