由于產(chǎn)生毒素的霉菌無處不在，以及我們對大多數(shù)有利于霉菌生長和霉菌毒素產(chǎn)生的條件控制不力，造成食品和飼料的霉菌毒素污染問題越來越成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中不可忽視的重大難題。在各種農(nóng)產(chǎn)品上生長著的各種各樣的霉菌，這些霉菌都能產(chǎn)生霉菌毒素，霉菌毒素是有毒的化合物，有些甚至是致癌的。霉菌毒素有很多種（CAST,2003）,包括黃曲霉毒素，主要是黃曲霉毒素B1和M1（Aflatoxins,FB1、FM1）;赭（棕）曲霉毒素A（OchratoxinA,OA）;雜色（柄）曲霉毒素（Terigmatocystin）;展青霉素（Patulin,PTL）;玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN（F-2））;串珠鐮刀菌素（Moniliformin,MF）,三硝基丙酸以及屬于單端孢霉烯族化合物（Trichothecenes）的T-2毒素（T-2toxin,T-2）;脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（嘔吐毒素）（Deoxynivalenol,DON）;二乙酰鑣草鐮刀菌烯醇（Diacetoxyscirpenol,DAS）等。
聯(lián)合國糧農(nóng)組織在近期的報道中指出，全世界至少99個國家，占世界人口的87%,針對糧食和飼料的霉菌毒素污染問題都有相關的規(guī)定。在未來的幾年里，與不斷變化的全球氣候有關的氣象突發(fā)事件的增多將進一步向我們提出挑戰(zhàn)。霉菌毒素污染給糧食生產(chǎn)者、 家禽生產(chǎn)者以及食品和飼料的加工企業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。
一、飼料霉變對畜牧業(yè)的危害
霉菌毒素污染的飼料對動物生產(chǎn)性能帶來的負面影響有些是察覺不到的， 有些卻是破壞性的。世界范圍內，養(yǎng)殖業(yè)每年因霉菌毒素對飼料的污染造成的經(jīng)濟損失就有幾百億美元。黃曲霉毒素污染造成經(jīng)濟損失包括它能使動物生長受阻、 飼料適口性降低、食欲減退、飼料轉化效率下降、死亡率增加、降低繁殖性能、蛋雞產(chǎn)蛋量減少、 肉雞腿病和胴體污染、內臟出血、肝臟受損、胚胎中毒和對環(huán)境應激和病原微生物的抵抗力下降等等。
肉雞黃曲霉毒素中毒后，血液中總蛋白、 膽固醇和血液尿素氮的含量減少。還發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素影響維生素D的代謝，造成骨骼強度下降，腿軟弱無力。另外黃曲霉毒素還影響幾種礦物元素的代謝，如鐵（引起溶血性貧血）、 磷（引起腿軟弱無力）.
霉菌毒素主要通過影響細胞和體液免疫功能來降低動物機體的抵抗力。大量研究表明，黃曲霉毒素引起肉雞的免疫功能抑制進而增加對疾病的易感性，飼以蛋雞50～200μg/kg黃曲霉毒素的日糧，其產(chǎn)蛋率和孵化率顯著降低；對肉雞的研究表明，日糧中100～200μg/kg的黃曲霉毒素可顯著降低粘囊重量，對肉雞免疫功能產(chǎn)生不良影響。當實驗動物接觸單端孢霉毒素后，會導致其對傳染病的易感性。黃曲霉毒素對免疫系統(tǒng)的影響有如下幾方面：法氏囊和胸腺的體積變��；T淋巴細胞、B淋巴細胞和白細胞的數(shù)量減少；血清總蛋白和免疫球蛋白水平降低；抗體滴度下降；血清中抗生素濃度下降等。單端孢霉毒素也可影響抗體的產(chǎn)生，這使得機體反應在免疫程序中減弱。赭曲霉毒素A對免疫功能有抑制作用。這和赭曲霉毒素的致癌作用有肯定的聯(lián)系。
霉菌及其代謝產(chǎn)物（主要是霉菌毒素）在動物性食品中殘留可通過食物鏈而對人類健康構成潛在危害。黃曲霉毒素Ml是黃曲霉毒素B1在哺乳動物體內的主要代謝產(chǎn)物。存在于動物的乳汁、肝、蛋類等可食部分，常見于乳汁中，它有很強的毒性和致癌性。由于乳及乳制品是嬰幼兒的主食，而嬰幼兒的解毒功能器官發(fā)育不完善，因此對嬰幼兒健康有直接的威脅。赭曲霉毒素A在動物產(chǎn)品中的殘留問題也已引起重視。Krogh等證實該毒素可在腎、肝和肌肉中殘留。
二、飼料中霉菌毒素的定性和定量檢測
隨著環(huán)境的惡化，人民生活水平的提高，人們對飼料污染和食品安全的關注程度正在不斷地加強。霉菌毒素作為影響飼料品質和人類健康的重要因素也逐漸明朗起來，對食品和飼料中霉菌毒素的定性和定量檢測技術的出現(xiàn)為人畜的健康提供了有力保障。鑒于霉菌毒素獨特的結構，尋找快速、高靈敏度、高特異性的霉菌毒素檢測方法，顯得尤為重要。根據(jù)最近幾年的報道總結，一類是生物學檢測法， 包括種子發(fā)芽試驗、嘔吐試驗等，很不利于快速檢測，已很少采用；一類是理化檢測法， 薄層色譜法（TLC）和高效液相色譜法（HPLC）.TLC雖然簡便，但靈敏度差； HPLC雖然靈敏度高，但樣品處理煩瑣，操作復雜，儀器昂貴，標準品耗用大。另一類是免疫化學檢測法，如ELISA方法和膠體金免疫層析方法。
2.1目測法
當出現(xiàn)畜禽拒食，飼料和谷物發(fā)熱，有輕度異味，色澤變暗，飼料結塊等跡象時應考慮飼料可能霉變。因霉菌都是從霉菌孢子或是菌絲體碎片開始生長的，霉菌生長時消耗了養(yǎng)分，代謝中有能量釋放，故而使飼料變色、變味、發(fā)熱。
菌絲體可與飼料縱橫交織，形成菌絲蛛網(wǎng)狀物，這些結構使得飼料結塊。在我們肉眼所能夠觀察到這些菌絲網(wǎng)狀物以前，菌絲體已經(jīng)在大范圍內生長繁殖。因此，飼料結塊是診斷飼料霉變的最簡易實用的方法之一。
不同的霉菌菌落各有其特征，通過顯微鏡觀察可進一步檢測確認。
1.2.1 曲霉屬
此屬菌的菌落顏色多樣，而且比較穩(wěn)定，是分類的主要特征之一。曲霉菌落表面一般呈絨毛狀，起初為白色或灰白色，長出孢子后則顯現(xiàn)出不同的顏色，隨菌種而異。如黃曲霉毒素產(chǎn)毒菌株長出黃綠色分生孢子，此時將培養(yǎng)皿置于365 nm紫外燈下，菌絲體出現(xiàn)亮紫色熒光。寄生曲霉由致密的基層菌絲組成，具有較寬、白色、幾乎不形成孢子的邊緣，前期呈明顯的淡黃色，以后呈草綠色，最后呈暗濁黃綠色，其小梗是純單層。雜色曲霉小梗嚴格雙層，分生孢子頭呈典型的放射狀，明顯的綠色，分生孢子梗無色或淺褐色。
1.2.2 青霉屬
青霉的菌落大多呈灰綠色。菌落有絨狀、絮狀、繩狀和束狀4種類型。有的青霉菌菌落具有放射性皺褶，有的形成同心輪紋，有的在基質表面有滲出液。顯微鏡下觀察時可見到獨特的帚狀體結構。
1.2.3 鐮刀菌屬
鐮刀菌菌落一般呈白色絨毛狀，常產(chǎn)生可溶性色素。分生孢子有大小2種類型，顯微鏡下大型分生孢子大多呈鐮刀形，多隔；小型分生孢子有卵形、梨形、圓形和柱形等。
2.2薄層層析法（TLC）
TLC法是我國測定食品及飼料中霉菌毒素的國家標準方法之一，其原理是針對不同的樣品，用適宜的提取溶劑將霉菌毒素從樣品中提取出來，經(jīng)柱層析凈化，再在薄層板上層析展開、分離，利用霉菌毒素的熒光性，根據(jù)熒光斑點的強弱與標準比較測定其最低含量。TLC法由于設備簡單，易于普及，所以國內外仍在使用，但該法樣品前處理繁瑣，且提取和凈化效果不夠理想，提取液中雜質較多，在展開時影響斑點的熒光強度，而雙向展開雖避免了雜質干擾，但增加了操作步驟和時間（葉雪珠，2003）.
2.3色譜法（HPLC）
色譜法，包括薄層色譜、氣相色譜、液相色譜等，一直是最重要的真菌毒素的化學分析方法。薄層色譜由于方法靈敏度和分離效率等問題，1985年以后便很少用了，然而，在發(fā)現(xiàn)確證新毒素、快速監(jiān)測方法建立、毒素分析方法研究等方面，尤其是當實驗條件有限時，薄層色譜還是有其優(yōu)越性的；氣相色譜，包括氣相色譜-質譜聯(lián)用技術，更多的是用在單端孢霉烯族毒素的分析上；現(xiàn)在比較普遍的真菌毒素的分析方法還是液相色譜法，包括液相色譜-質譜聯(lián)用技術，在方法適用性、分離效率和靈敏度方面，液相色譜法及液相色譜-質譜聯(lián)用技術都是其他方法所無法替代的。近年來，毛細管電泳及毛細管電泳-質譜聯(lián)用技術以其高分離效率也開始應用在真菌毒素分析領域并引起了廣泛關注。
總之，HPLC法是近幾年發(fā)展起來的檢測霉菌毒素方法，主要是用熒光檢測器檢測，在適宜的流動相條件下，采用反相C18柱，使霉菌毒素同時分離。該法快速而準確， 純化效果好，最低檢出量0.08ng,回收率為92.87%,但需要昂貴的儀器設備，僅限于專業(yè)檢測機構獲得科研和調查分析、監(jiān)測使用，未能在企業(yè)廣泛推廣使用，而且其結果的滯后效應大大降低了對生產(chǎn)實際的指導效果。
2.4免疫化學檢測法
免疫學檢測方法是基于抗體與抗原或半抗原之間的選擇性反應而建立起來的一種生物化學分析法。通常具有高的選擇性和很低的檢出限，廣泛用于各種抗原、半抗或抗體的測定，一般可分為熒光免疫法、發(fā)光免疫法、免疫法及電化學免疫法等非放射免疫法和放射免疫法，其中在飼料霉菌毒素檢測中應用較廣的主要是酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和膠體金免疫層析方法。ELISA 法特別適宜大批樣品集中檢測，膠體金免疫層析方法適合現(xiàn)場單個或少數(shù)樣品即時檢測。
1977年美國Lawell 等首先建立了ELISA競爭法檢測AFB1 .隨后美國學者朱繁生教授、英國學者Morgan 教授分別改進了該法。我國李秀芳和俞順章教授分別于1987年與90 年代建立了ELISA 法檢測AFB1 ,成恒嵩教授等起草了飼料中AFB1 的ELISA檢測方法國家標準，并于1998 年由國家質量技術監(jiān)督局正式批準頒布實施。
免疫學檢測方法由于其快速、靈敏、準確、可定量、操作簡便、無需貴重儀器設備，且對樣品純度要求不高等特性，特別適用于飼料廠進行原料或成品的檢測。其基本原理是在合適的載體上，酶標記抗體或抗原與相應的抗原或抗體形成酶標記的抗原抗體復合物，在酶底物參與下，復合物上的酶催化底物使其水解，氧化或還原成為另一種帶色物的抗原和抗體的含量。該免疫學方法更實際，其靈敏度與TLC或HPLC法相當，因而具有更廣闊的應用前景。
該類方法有以下特點：1） 靈敏度高：免疫層析法可檢出量可達ng級，ELISA 法最低檢出量可達pg級，并可定量測定。2） 干擾小：抗體抗原的免疫反應特異性很強，結構類似物、熒光物質、有色物質對檢測的干擾很小。3） 操作簡便快捷：由于特異性強，簡化了樣品的預處理和提取純化過程，同時操作步驟也非常簡便，測定時間也短。4） 安全性高，污染少，成本低廉：不需要昂貴的測定儀器，所用試劑也相對較少，特別是因為靈敏度高，毒素標準品的濃度可以很低，減少了對檢測人員和環(huán)境的潛在危害和污染。
三、國內幾種真菌毒素檢測方法的研究進展
3.1 黃曲霉毒素B1是二氫呋喃氧雜萘鄰酮的衍生物。即含有一個雙呋喃環(huán)和一個 氧雜萘鄰酮（香豆素）.前者為基本毒性結構，后者與致癌有關。國內最早研究真菌毒素免疫檢測方法的是中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所的孫宗棠，他于1983年建立了AFB1單克隆抗體放射免疫測定方法。1992年，中國科學院上海細胞所李永鏞和上海醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院殷芬、俞順章等人合作建立了AFB1單克隆抗體的酶聯(lián)免疫檢測方法。中國預防醫(yī)科院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所和江蘇微生物所也先后建立了AFB1多克隆抗體的酶聯(lián)免疫測定方法。北京市營養(yǎng)源研究所路戈與中國醫(yī)科院腫瘤研究所王德斌和衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗所計融等人合作于1994年建立了規(guī)范的AFB1單克隆抗體酶聯(lián)免疫檢測方法，該法已列為國家標準（GB/T5009.22-1996）.在1985年以前，另有幾種熒光色譜法列為國家標準（GB/T5009.23-1996;GB/T5009.24-1996）.其中薄層色譜法由衛(wèi)生研究所和青島商品檢驗局于1973年建立（GB/T5009.22-1996）.
3.2 T-2毒素為劇毒（豬靜注LD50=1.2mg/kg）,具有明顯的細胞毒，而且是體內蛋白質合成的抑制劑，有致畸性和致突變性。中毒后嘔吐，腹瀉，嚴重時損傷造血組織。T-2毒素的免疫檢測方法由衛(wèi)生部食檢所陽傳和、羅雪云、計融于1991年建立（GB/T14933-94）,方法最低檢出量為1ng/ml,敏感范圍為4-1000ng/ml.這是首次采用免疫技術建立的檢測真菌毒素的國家標準。
3.3 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（嘔吐毒素，DON）是較早（1970年）被分離提純后命名的真菌毒素，毒性弱于T-2毒素，（小鼠經(jīng)口LD50=9.2mg/kg）中毒癥狀類似，有明顯的致吐作用。DON經(jīng)對甲基苯甲醛噴霧后呈黃色，衛(wèi)生部食檢所魏潤蘊于1986年建立了DON薄層層析檢測方法（GB/T14929.5-1994）.DON免疫檢測方法由衛(wèi)生部食檢所陽傳和、計融于1992年建立，方法最低檢出量為5ng/ml,敏感范圍為5-1000ng/ml,該法已批準為國家標準（GB/T14929.5-1994）.小麥、面粉、玉米及玉米粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇限量標準已于1996年9月1日頒布實施（GB16329-1996）,最高允許量1000μg/kg .
3.4二乙酰鑣草鐮刀菌烯醇（DAS）的毒性強于T-2毒素（豬靜注LD50=0.367mg/kg）,1992年，衛(wèi)生部食檢所李業(yè)鵬、羅雪云等用酶標記單克隆抗體建立了檢測DAS的雙抗夾心酶免疫斑點檢驗方法，最低檢出量為10ng/ml,敏感范圍為2-1000ng/ml.
3.5玉米赤霉烯酮（ZEN,F-2）是另外一種從赤霉病麥中分離出來的真菌毒素（化學名稱為6-（10-羥基-6-氧基碳烯基）-β-雷鎖酸-μ-內酯，分子量為318）,主要污染小麥、大米、玉米、蕎麥等谷物，是一種生殖系統(tǒng)毒素，有強烈致畸作用。ZEN在波長為254nm短紫外光照射下發(fā)出蘭綠色熒光，衛(wèi)生部食檢所羅雪云、胡霞于1992年建立ZEN薄層層析分析方法，最低檢出量為50μg/kg.1993年中國農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)所王景琳、張志東等建立了ZEN單克隆抗體酶聯(lián)免疫檢測方法，最低檢出量為0.3ng/ml.1995年，北京市營養(yǎng)源研究所路戈等也建立了ZEN單克隆抗體免疫檢測方法，最低檢出量為1ng/ml,敏感范圍5-1000ng/ml,該法已通過國家標準審查。
3.6 赭曲霉毒素A（OA）主要表現(xiàn)為很強的腎臟毒（大鼠經(jīng)口LD50=20mg/kg）并有致畸性和致癌性，污染的谷物主要為麥類及玉米。在紫外光下赭曲霉毒素A呈綠色熒光，衛(wèi)生部食檢所于1991年建立了OA薄層層析分析方法，已列入國家標準（GB13111-91）.1992年該所陽傳和、羅雪云等又建立了OA單克隆抗體免疫檢測方法，也已經(jīng)被批準為國家標準。
3.7 黃曲霉毒素M1（AFM1）是AFB1經(jīng)動物代謝產(chǎn)生的衍生物，可以從內臟、尿和乳汁中測出。尿或乳汁中排出的AFM1的量約為攝入AFB1量的1%.AFM1的毒性（鴨雛經(jīng)口LD50≈0.32mg/kg）僅次于AFB1,致癌性也相似。因此乳及乳制品中AFM1的污染控制是食品衛(wèi)生工作的重要環(huán)節(jié)。我國規(guī)定牛乳中AFM1的含量不得超過0.5μg/kg,乳制品按實際含乳量折算（GB9676-88）.1980年衛(wèi)生研究所胡文娟、韓玉蓮（AFM1在波長365nm紫外光照射下呈蘭紫色熒光）建立了檢測幾種主要動物性食品中AFM1的薄層層析法，最低檢出量為0.1～0.5μg/kg（GB/T5009.24-1996）.1992年中國預防醫(yī)科院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所的劉興介等人利用美國威斯康星大學朱繁生教授提供的單克隆抗體應用ELISA直接競爭法測定了97份乳粉樣品中的AFM1含量。（陽性率84.5%,超標率39.2%,最高4.16ng/g）1996年，衛(wèi)生部食檢所李燕俊、計融開始研究AFM1的免疫檢測技術，目前主要工作已經(jīng)完成。
3.8雜色曲霉素（柄曲霉素，分子量324）是一種很強的肝及腎臟毒素�？蓪е履懝馨┖透伟�，有致突變性，但對食品的污染頻率較低。雜色曲霉素經(jīng)三氯化鋁噴霧后加熱，可在365nm波長紫外光下呈黃色熒光。衛(wèi)生研究所建立的檢測雜色曲霉素的薄層色譜法已于1984年列為國家標準（GB/T5009.25-1996）.該法對大米、玉米、小麥的最低檢出量為25μg/kg,黃豆、花生為50μg/kg.
3.9展青霉素（PTL）有致癌性，也有致畸、致突變作用，在水果制品中的污染較為嚴重。1998年衛(wèi)生研究所劉勇、胡文娟建立了蘋果、山楂制品中展青霉素的薄層掃描測定法。該法于1994年列為國家標準，同時還規(guī)定了展青霉素的限量衛(wèi)生標準（GB14974-94）.1992年吳南建立了用高效液相色譜法測定展青霉素的方法，最低檢出量為2μg/kg.
3.10串珠鐮刀菌素（MF）屬劇毒物，有很強的心臟毒，中毒死亡后可見心肌壞死性病變，近年研究表明該毒素可能是克山病主因。串珠鐮刀菌廣泛污染糧食作物，其中對玉米的污染率較高。1984年，俞世榮、王玉華建立了串珠鐮刀菌素的薄層及高效液相色譜測定法。
四、小結與展望
因化學加工、人為添加而引入食品中的有毒化合物所造成的危害是可以被預防的；而以食品的天然組分形式存在的天然霉菌毒素則不易被識別，且由于潛在毒性大，從而會對消費者的健康造成很大的威脅。霉菌毒素是霉菌次級代謝產(chǎn)物，屬于化學污染物，對人和動物都會產(chǎn)生非常嚴重的危害。拿黃曲霉毒素來說，含有黃曲霉毒素的食品被人誤食后容易出現(xiàn)肝臟病變，甚至導致肝癌；所以，霉菌毒素檢測是非常迫切需要解決的問題。
可以說，越早進行霉菌毒素檢測就越容易將霉菌毒素產(chǎn)生的危害降到最低。如能從源頭就發(fā)現(xiàn)霉菌毒素，則更便于及早采取合理的措施控制霉菌毒素，以免受霉菌毒素污染的飼料給養(yǎng)殖業(yè)帶來危害，從而使企業(yè)包括食品安全蒙上陰影。實際操作中，如果在飼料原料采購環(huán)節(jié)就采用快速篩選的方法，查看飼料原料是否含有霉菌毒素，則可以使企業(yè)避免使用含霉菌毒素的原料生產(chǎn)飼料，或者在原料緊缺又必須生產(chǎn)的情況下，可以針對檢測結果采取有效的霉菌毒素處理技術，全面降低霉菌毒素的毒害性。
所以，研制對霉菌毒素快速、高靈敏、高特異性的檢測方法顯得尤為重要。高效液相色譜、質譜檢測法，可做出精確定性定量測定，運用恰當甚至可測到各組分的含量，它們靈敏度高、選擇性強，有極好的發(fā)展前景，但是樣品前處理要求嚴格，標準品純度有一定的要求，而且儀器昂貴，測試人員往往還要進行專門的培訓，因此成本較高。所以，僅適合大型企業(yè)或對檢測靈敏度要求較高的科研院校、檢測機構等單位使用。免疫學檢測方法尤其是酶聯(lián)免疫吸附法具有靈敏度高，干擾少，測定步驟簡便、快速，操作安全，設備投資少，測定結果準確可靠等特點。所以，免疫分析法仍常常作為一些單位的首選，但是往往一次性需要較多的樣品，單一樣品處理在經(jīng)濟上是不合算的。在傳統(tǒng)檢測方法基礎之上，近年來發(fā)展了許多新的檢測方法，其中值得一提的是，最近建立的基于基因工程單鏈抗體（scFv）競爭ELISA檢測方法，相比傳統(tǒng)方法，具有很多優(yōu)勢：首先，基因工程單鏈抗體（scFv）可以在大腸桿菌中快速、大量地得到表達，而常規(guī)地ELISA使用的單克隆抗體要利用雜交瘤技術生產(chǎn)，費時、費力、成本高。其次，基因工程單鏈抗體基因容易和其他小分子如報告基因融合，形成融合蛋白以用于檢測或其它用途。另外，霉菌毒素快速檢測試紙法應用于飼料原料檢測，可以快速得到結果，為飼料、養(yǎng)殖企業(yè)應對霉菌毒素潛在危害的處理提供直接的、事先的、相對合理的科學依據(jù)。當原料快檢呈陽性結果時表明樣品中毒素的殘留限量在限值以上，與目前市售的試劑盒相比，具有快速、方便、便宜和現(xiàn)場性等特點，加上其成本只有進口同類產(chǎn)品的40%左右，完全可以替代進口產(chǎn)品。
